ПРИМЕНЕНИЕ УЛЬТРАЗВУКА В МЕДИЦИНСКОЙ И ВЕТЕРИНАРНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

Ультразвуковые методы весьма перспективны для применения в биотехнологии, так как в зависимости от характера поставленной задачи позволяют, подбирая параметры ультразвукового воздействия, интенсифицировать или подавлять те или иные физико-химические и биологические процессы, увеличивать выход конечного продукта и уменьшать расход сырья, сделать отдельные процессы производства более технологичными и создать такие, которые без применения ультразвука были бы просто невозможны.

Ультразвук в криобиологии и криоконсервировании

Давно известно, что при понижении температуры замедляются биохимические процессы, лучше и дольше сохраняются биологические ткани. Поиск способов длительного хранения жизнеспособных клеток и тканей привел к разработке ряда новых методов их консервирования холодом и даже появлению новой науки - криобиологии. Успехи криобиологии открывают широкие возможности сохранения генофонда диких и сельскохозяйственных животных и растений, консервации и длительного хранения их репродуктивных клеток, сохранения клеток крови и костного мозга, а также отдельных тканей и даже органов для трансплантации.

Охлаждение живых клеток до температур ниже О °С сопровождается замораживанием внутри- и внеклеточной воды, что приводит к образованию в клетке и вне ее кристаллов льда, возникновению механических напряжений, резкому увеличению концентрации растворенных солей в результате вымораживания чистой воды, изменению pH среды. Эти процессы могут привести к нарушению структурной целостности клеток, нарушению их функций, изменению транспорта веществ через клеточные мембраны и, следовательно, к изменению состава внутриклеточной среды. Для защиты клеток от отрицательных воздействий при замораживании используют некоторые вещества - криопротекторы, - существенно уменьшающие повреждения клеточных и тканевых структур.

Основные нарушения в клетках при криоконсервировании обусловлены механическими напряжениями, возникающими в биологической среде при замораживании. Следовательно, криорезистентность клеток тем выше, чем выше их устойчивость к механическим воздействиям, а механическую резистентность легко оценить, используя метод ультразвуковых цитолизограмм (см. § 2.4).

При добавлении криопротектора к среде физико-химические свойства раствора стабилизируются не сразу и продолжают меняться в течение нескольких часов или даже суток до тех пор, пока раствор не станет гомогенным. Воздействие низкочастотным ультразвуком (35 кГц) мощностью 15... 100 Вт существенно ускоряет растворение криопротектора в жидких средах и в течение нескольких минут стабилизирует параметры раствора. Даже отстоявшиеся в течение недели растворы кри- опротективных веществ, например глицерина или полиэтиленоксида, после ультразвуковой обработки становятся более гомогенными, о чем свидетельствуют результаты рентгеноструктурного анализа их замороженных образцов. В разбавителе спермы ультразвук диспергирует лецитин с сохранением его ламелярной структуры, что существенно улучшает качество разбавителя, повышает его защитные свойства.

Клетки и ткани, помещенные в раствор криопротектора, должны выдерживаться в нем до тех пор, пока не будет достигнуто насыщение. Время эквилибрации, т. е. период, в течение которого криопротекторы насыщают клетку, также может быть сокращено с использованием ультразвука, так как, увеличивая проницаемость клеточных мембран, ультразвук ускоряет процесс переноса веществ через эти мембраны.

Ультразвук может быть полезен и для определения степени насыщения клеток в суспензии, а также тканей и органов криопротектором. При перфузии изолированного органа перед низкотемпературной консервацией раствором криопротектора измеряют и сравнивают скорости ультразвука в подводимом к органу и оттекающем от него

Ультразвуковой метод контроля степени насыщения почки криопротектором

Рис. 5.6. Ультразвуковой метод контроля степени насыщения почки криопротектором:

V, - скорость ультразвука на входе; V2 - скорость ультразвука на выходе

растворе (рис. 5.6). Когда происходит насыщение, концентрация криопротектора и, следовательно, скорость ультразвука в подводимой и отводимой жидкости уравниваются.

При замораживании подготовленных для криоконсервирования образцов подбирают такие режимы охлаждения, чтобы образующиеся кристаллы льда как можно меньше травмировали клеточные мембраны. Если жидкость, не содержащую зародышей кристаллизации, медленно охлаждать, то она может переохладиться, оставаясь в жидком состоянии при температурах ниже точки замерзания. Этот нежелательный для криоконсервирования эффект можно предотвратить, замораживая образцы в ультразвуковом поле (рис. 5.7). В данном случае влияние ультразвука обусловлено увеличением количества центров кристаллизации. В результате в среде формируется множество кристаллов, размеры которых сравнимы с размерами клетки. Кроме того, кристаллы льда растут с большим числом разветвлений, что также способствует выживанию клеток.

Влияние ультразвука (0,88 МГц) на степень переохлаждения растворов криопротекторов при их замораживании

Рис. 5.7. Влияние ультразвука (0,88 МГц) на степень переохлаждения растворов криопротекторов при их замораживании

В охлажденном растворе, прежде всего, начинает вымерзать чистая вода, а в незамерзшей части жидкости быстро возрастает концентрация солей, и раствор становится гипертоническим. В такой среде клетки испытывают существенные изменения: они обезвоживаются, меняется соотношение ионов во внутриклеточной среде. Интенсивно перемешивая жидкую среду как внутри клеток, так и вне их, ультразвуковые микропотоки способствуют равномерному распределению солей и уменьшают вредные последствия пребывания клеток в гипертоническом растворе.

Качество спермы сельскохозяйственных животных, замороженной в ультразвуковом поле (880 кГц; 0,1...0,2 Вт/см2), после размораживания значительно выше, чем качество спермы, криоконсервиро- ванной без ультразвукового воздействия. Средняя активность сперматозоидов увеличивается на 1-2 балла, повышается абсолютный показатель живучести и удлиняется промежуток времени, в течение которого сперматозоиды остаются способными выполнять свои биологические функции.

Ультразвуковая обработка эритромассы, защищенной криопротектором (глицерином или полиэтиленоксидом), также способствует повышению криорезистентности клеток.

Клетки костного мозга, содержащие ядра, так же, как и безъядерные эритроциты, лучше сохраняются при криоконсервировании с использованием ультразвука. Сохранность клеток повышается по мере увеличения интенсивности ультразвукового воздействия до 0Д..0.9 Вт/см2. Ультразвук с частотой 880 кГц эффективнее ультразвука с частотой 2640 кГц. В первом случае различие в сохранности клеток в контрольных и опытных образцах составляет 12 %, а во втором -9%. Ультразвук с интенсивностью, превышающей 0,9 Вт/см2, снижает сохранность клеток. Эффект объясняется тем, что наряду с положительным воздействием на процессы криоконсервирования, ультразвук при высоких интенсивностях способен разрушать клетки в суспензии.

Процесс размораживания при криоконсервировании биологического материала не менее важен, чем процесс замораживания, так как физико-химические процессы в обоих случаях сходны, что позволяет и здесь успешно использовать ультразвуковое воздействие.

Размораживание в ультразвуковом поле осуществляется при воздействии ультразвуком на контейнеры с замороженными клеточными суспензиями, помещенными в водяную баню с температурой

40...45 °С. Оттаивание продолжают до тех пор, пока температура суспензии не достигнет 5... 10 °С. Размораживание в ультразвуковом поле способствует повышению сохранности клеток на 20...25 %. Эффект обусловлен не только микротечениями, ускоряющими теплообмен и снижающими температурные градиенты как внутри, так и снаружи контейнеров, но и действием ультразвука, стимулирующим репаративные процессы в клетках.

В последнее время растет интерес к проблеме криоконсервирования эмбрионов человека и животных. Решение этой проблемы наталкивается на ряд трудностей. Так, исследование возможности криоконсервирования ооцитов свиньи выявило их высокую криочувствительность. Поиск путей сохранения ооцитов при замораживании привел к использованию ультразвука низких интенсивностей для повышения их сохранности. Однако лабильные к замораживанию ооциты оказались чувствительными к ультразвуковому воздействию. Наиболее устойчивы мелкие, незрелые ооциты без четко выраженных гранул в цитоплазме. Более зрелые клетки средних размеров, характеризующиеся относительно большой растяжимостью, имеют повышенную чувствительность к ультразвуку.

Чаще всего наблюдается удаление клеток лучистого венца, нередки разрывы в плазматической мембране, деформация ооцитов, частичная дегидратация и другие нарушения. Обработка ультразвуком с интенсивностью 0,05...0,1 Вт/см2 в течение 0,5 мин в процессе экви- либрации с криопротектором, а также во время размораживания, увеличивает морфологическую сохранность законсервированных ооцитов до 65 %, по сравнению с 45 % в контрольных образцах, и способствует их дальнейшему развитию в культуре.

Анализ многочисленных данных о влиянии низких температур и ультразвука на ткани и клетки в суспензии свидетельствует о значительной роли цитоплазматических мембран в формировании ряда реакций биологических систем на ультразвуковое и криовоздействие. Мембранные структуры способны по-разному реагировать на действие каждого фактора, в зависимости от его параметров, и результирующий эффект комбинированного воздействия зависит от того, суммируются ли эффекты их влияния или имеет место частичная или полная взаимокомпенсация.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >