Влияние ультразвука на биосинтез интерферона

Воздействие ультразвуком низких интенсивностей на клетки в суспензии или культуре может обусловить стимуляцию процессов их жизнедеятельности. Известно, например, что в относительно мягких условиях ультразвуковой обработки (0.05...0.5 Вт/см2; 0,88 МГц; 30 с) ускоряется процесс синтеза соединительнотканого белка в культуре фибробластов.

Представляет практический интерес возможность стимуляции синтеза и ряда других белков в клетках, в частности биосинтеза интерферона в индуцированных вирусом лейкоцитах.

Интерферон синтезируется в клетках организма и в культуре тканей в ответ на воздействие природных и искусственных индукторов - вирусов, эндотоксинов, внутриклеточных паразитов, высоко- и низкомолекулярных соединений. Помимо антивирусной активности, интерферон проявляет способность подавлять размножение быстроде- лящихся клеток, обладает иммуномодулирующим действием. Он эффективен как радиозащитное и антитоксическое средство.

Интерферон, будучи важнейшим неспецифическим фактором повышения резистентности, продуцируется почти сразу после попадания индуктора биосинтеза, например вируса, в организм, однако естественно образующегося интерферона часто оказывается недостаточно для предупреждения развития болезни. Воздействие ультразвуком терапевтических интенсивностей на область локализации патологического процесса, очевидно, приводит к стимуляции биосинтеза интерферона. Не исключено, что именно этот эффект лежит в основе ультразвуковой физиотерапии вирусных кератитов.

При ряде патологий весьма эффективно введение в организм экзогенного интерферона, полученного либо в результате химического синтеза, либо генно-инженерными методами, либо при его биосинтезе в культуре лейкоцитов, индуцированных вирусом.

Для получения наиболее качественного (лейкоцитарного) интерферона лейкомассу из свежей крови фракционируют, обрабатывают гомологичным интерфероном (проводят прайминг) и индуцируют биосинтез интерферона каким-либо вирусом, например вирусом Сендай или вирусом болезни Ньюкасла. После этого клетки помещают в специально подобранную среду и выдерживают при температуре 37 °С, постоянно перемешивая. Через 16...18 ч клетки отделяют и выделяют из среды интерферон, активность которого можно оценить по

Воздействие ультразвуком с частотой 880 кГц и интенсивностью 0,05...0,6 Вт/см2 в течение 130...300 с на суспензию лейкоцитов до прайминга или после него, но до вирусной индукции, не приводит к заметному изменению количества синтезированного интерферона. Ультразвук с интенсивностью, превышающей 0,6 Вт/см2, подавляет процесс биосинтеза.

его способности защищать клетки в культурах тканей от цитопатиче- ского действия вируса.

Снижение числа жизнеспособных клеток(лейкоцитов) в суспензии под воздействием ультразвука

Рис. 5.8. Снижение числа жизнеспособных клеток(лейкоцитов) в суспензии под воздействием ультразвука

Воздействие ультразвуком с интенсивностью от 0,01 до 0,05 Вт/см2 на лейкоциты после вирусной ин-

дукции практически не влияет ни на скорость биосинтеза интерферона, ни на жизнеспособность клеток, оцениваемых по их окрашиваемое™ красителем трипановым синим. Мосле обработки ультразвуком с интенсивностью 0,1 Вт/см2 в суспензии обнаруживается около 10 % погибших клеток. Дальнейшее увеличение интенсивности ультразвука приводит к экспоненциальному росту числа нежизнеспособных (прокрашиваемых) клеток, а после обработки ультразвуком интенсивностью 0,7 Вт/см2 в суспензии остается 65 % жизнеспособных лейкоцитов (рис. 5.8).

Существенное увеличение скорости гибели клеток при интенсивностях ультразвука, превышающих 0,7 Вт/см2, обусловлено кавитацией, порог возникновения которой зависит от объемной концентрации клеток в среде, в разбавленных суспензиях совпадает с порогом кавитации в воде (0,3 Вт/см2) и становится весьма значительным, если объем частиц в суспензии превышает 2%. Согласно теоретическим оценкам и экспериментальным данным, порогу кавитации в суспензии лейкоцитов, содержащей 3 • 106 кл./см3, соответствует интенсивность ультразвука 0,6 Вт/см2.

Облучение ультразвуком суспензии лейкоцитов в течение 5 мин с интенсивностью от 0,05 до 0,6 Вт/см2 приводит к увеличению на 30 % количества интерферона, синтезируемого жизнеспособными клетками. Дальнейшее увеличение интенсивности ультразвука обусловливает резкое снижение количества синтезированного интерферона (в пересчете на жизнеспособные клетки). Ультразвук, интенсивность которого превышала 1 Вт/см2, приводил к практически полному подавлению биосинтеза (рис. 5.9), хотя, как было указано выше, в этих условиях около половины исходного количества клеток в суспензии не прокрашивается трипановым синим, т. е. они являются, судя по этому, вполне жизнеспособными.

Подавление биосинтеза интерферона в лейкоцитах при интенсивностях ультразвука, превышающих порог кавитации, очевидно, обусловлено процессами, сопровождающими кавитацию, например интенсивными микропотоками, возникающими как вне, так и внутри клеток. Эти микропотоки вызывают грубое нарушение внутриклеточной архитектоники, что приводит к подавлению биохимических реакций, в частности биосинтеза интерферона.

Влияние ультразвука на количество интерферона, синтезированного лейкоцитами в суспензии (в расчете на количество жизнеспособных клеток)

Рис. 5.9. Влияние ультразвука на количество интерферона, синтезированного лейкоцитами в суспензии (в расчете на количество жизнеспособных клеток)

Факт увеличения количества интерферона, синтезируемого лейкоцитами в суспензии, не поддается однозначной интерпретации.

Увеличение интенсивности ультразвука в интервале от 0,1 до 0,6 Вт/см2 повышает скорость биосинтеза интерферона, но одновременно снижает число жизнеспособных клеток. Поэтому суммарный эффект невелик.

Обычно клетки, единожды использованные для синтеза интерферона, выбрасывают, так как при повторном использовании они дают незначительное количество препарата. Однако после трехминутного ультразвукового воздействия на «отработанные» клетки наблюдается стимуляция повторного синтеза интерферона (табл. 5.2). Максимальный выход препарата может быть получен при интенсивности ультразвука 0,01...0,2 Вт/см2. Ультразвук с интенсивностью выше 0,7 Вт/см2 резко ингибирует повторный синтез интерферона.

Таблица 5.2

Зависимость выхода интерферона (по активности препарата в международных единицах) от интенсивности ультразвукового воздействия на суспензии однократно использованных для биосинтеза лейкоцитов

Интенсивность ультразвука, Вт/смг

0

0,05

0,1

0,2

0,4

0,7

1,0

2,0

Титр (активность) интерферона, Mh

150

1200

1200

1200

900

900

150

150

Применение ультразвука для стимуляции позволяет на 20...25 % увеличить выход продукта и делает практически целесообразным повторное использование лейкоцитов.

Полученный очищенный интерферон хранят либо в виде раствора, либо в виде лиофильно высушенного препарата. При длительном хранении активность интерферона медленно снижается, что обусловлено агрегацией его молекул. Попадая в организм, интерферон связывается со специфическими рецепторами клеточной поверхности. Отдельная молекула или агрегат как одно целое могут связаться лишь с одним рецептором. Поэтому агрегация приводит к снижению количества действующих единиц, что равносильно снижению активности препарата.

Ультразвуковая обработка растворов интерферона с интенсивностью 1,0...1,5 Вт/см2 в течение 5... 10 мин увеличивает антивирусную активность интерферона в 2-4 раза. Судя по результатам электрофореза препаратов интерферона в акриламидном геле, ультразвуковое воздействие приводит к снижению концентрации в растворе частиц с молекулярной массой 120-140 тыс. дальтон и увеличению частиц с молекулярной массой 60-70 тыс. дальтон и 30-35 тыс. дальтон, что соответствует димерам и мономерам интерферона.

Клинические испытания показали целесообразность ультразвуковой обработки интерферона перед использованием для лечения вирусных заболеваний.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >