АДСОРБЦИОННЫЙ АНАЛИЗ И ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД ПРИМЕНЕНИЕ К ХИМИИ ХЛОРОФИЛЛА

(Поступило 21 июля 1906 г.)1

В предыдущем номере этого журнала я сделал сообщение о замечательных явлениях адсорбции хлорофильных пигментов твердыми телами из петролейно-эфирных или сероуглеродных растворов. Там было показано, как можно получить при помощи фракционированной адсорбции важные разделения, например, количественное отделение каротина. Дальнейшие применения методики будут опубликованы в позднейших работах. Здесь же мы коснемся ближе второй, наиболее важной формы адсорбционного анализа, которую я назвал методом хроматографического анализа. В качестве дополнения я буду говорить и о капиллярном анализе, буду сравнивать его с новой методикой как по существу, так и по применимости в работе.

Обоснования метода. Многие красящие вещества (и, само собой разумеется, также и бесцветные соединения), растворимые в петролейном эфире, бензоле, ксилоле, четырех-

1 Bericthe der deutschen botanischen Gesellschaft, Bd. 24 (1906), S. 384 — 393.

хлористом углероде или сероуглероде, осаждаются из своих растворов физически различными порошкообразными телами путем адсорбции, т. е. конденсации некоторого количества растворенного вещества на поверхности твердых частичек. Распределение вещества между растворителем и адсорбентом не следует закону Генри, как это уже известно для целого ряда явлений адсорбции (ср. например Ван-Бемме- лена), и коэффициент распределения зависит от концентрации. Для некоторых растворенных веществ и растворителей коэффициент этот бесконечно мал, и растворенное вещество целиком переходит в осадок и не может быть извлечено чистым растворителем. Образуются настоящие недиссоциирующие адсорбционные соединения. Кроме этого прочно удерживаемого количества растворенного вещества, адсорбент способен конденсировать и дальнейшие его количества, причем, быть может, начинает играть роль закон Генри. Избыток адсорбированного вещества может быть удален при помощи чистого растворителя. Из своих адсорбционных соединений вещества освобождаются при помощи спирта, эфира, ацетона, хлороформа или при помощи прибавления этих жидкостей к перечисленным выше растворителям. Адсорбент, насыщенный одним каким-либо веществом, может связать небольшое количество какого-либо другого, причем возможны взаимные замещения. Тело В может быть высвобождено из своего насыщенного адсорбционного соединения телом А, но не наоборот. Имеется адсорбционный ряд, согласно которому вещества могут заменять друг друга, но он зависит от характера растворителя.

Из сказанного следует: если сложный раствор (например, раствор хлорофилла в сероуглероде) фильтровать сквозь столб адсорбента, то пигменты в процессе адсорбции будут осаждаться, смещая друг друга и располагаясь по адсорбционному ряду вдоль по столбу и по направлению тока. Вещества, не образующие с примененным адсорбентом недиссоциирующих адсорбционных соединений, проходят более или менее быстро через весь столб. Последующее фильтрование чистого растворителя приводит, очевидно, к еще более совершенному разделению веществ. Возможна, однако, мысль, что два вещества занимают один и тот же адсорбционный ранг для какого-либо растворителя. Но и в этом случае образование одной общей смешанной зоны было бы предотвращено относительными различиями в концентрации этих веществ. Едва ли также возможна одинаковая адсорбционная потенция двух веществ в различных растворителях. Тем не менее, хотя число адсорбционных зон и отвечает числу разделяемых веществ, может случиться, что какая- нибудь из зон будет абсолютно чиста, как и следует из вышесказанного. В таком случае придется выделить вещество из этой зоны и достичь желаемой степени чистоты новым процессом адсорбции.

Мы видим, таким образом, что законы механического сродства могут быть применены к вполне совершенным физическим разделениям веществ, растворимых в определенных растворителях.

Хроматографические установки. Чтобы в течение нескольких минут получить представление о составе смеси пигментов, удобно воспользоваться изображенной на табл. XVIII, рис. 1 х, установкой.

Связанная с манометром М трехлитровая банка R служит резервуаром, в котором при помощи гуттаперчевой груши Р можно создать через трубку D определенное давление воздуха. Груша Р может быть герметически отчленена от остальных частей аппарата при помощи зажимного крана Q. Трубка D служит распределителем давления; она снабжена рядом трубчатых придатков, к которым причле- няются фильтрационные приспособления. Рис. 2 на таблице [1]

представляет одно из этих приспособлений.[2] Оно состоит из цилиндрического или колбообразного резервуара г, заканчивающегося цилиндрической трубкой/(30 — 40 мм длиною, 2—3 мм в диаметре). Трубка эта на своем конце несколько сужена, чтобы создать основу для помещаемого выше адсорбционного материала. Фильтрационная вороночка соединяется с распределителем давления D при помощи пробки со стеклянной трубкой и резиновой трубки. Зажимный кран q позволяет легко отчленять каждую вороночку от всей установки.

Описанное приспособление весьма удобно для быстрого разделения небольших количеств пигментных растворов. Если же желательно получить большие количества пигментов в виде их адсорбционных соединений, чтобы подвергнуть их дальнейшему изучению, предпочтительно другое приспособление. В этом случае удобнее работать с большего размера адсорбционными воронками (10 — 20 мм в диаметре), причленяемыми, как видно на рис. 4, к горлышку вытяжной колбы.

Техника. В качестве адсорбционного материала может служить всякое порошкообразное вещество, нерастворимое в данном растворителе. Но так как очень многие вещества оказывают химическое воздействие на адсорбированные тела, то выбор аналитика естественно падает на такие вещества, которые являются химически индифферентными и в то же время могут быть переведены в возможно тонкое порошкообразное состояние. Необходимо также избегать веществ с чересчур сильными адсорбирующими свойствами, так как при работах с ними для достижения дифференци- ровки потребовалось бы громадное количество пигмента. Тонкость адсорбционного порошка очень важна; при грубозернистом материале получаются размытые хроматограммы,

так как в нем интерферируют адсорбция и диффузия в чересчур широких капиллярах. Из адсорбентов я пока могу рекомендовать осажденный углекислый кальций, дающий прекрасные хроматограммы. Довольно легко привести в состояние необходимого распыления и сахарозу, представляющую вместе с тем наивысшую гарантию химической пассивности. Для специальных целей пригодны будут, наоборот, химически (гидролитически, восстановительно, окислительно) действующие адсорбционные вещества. Об этом в другом месте.

Для развития полной адсорбционной способности и создания правильной диффузии веществ необходимо следить за возможно более полной сухостью адсорбента. Обычно применяемый мною СаСОв я сушу два часа при 150° и храню в хорошо закупоренных банках. На дне адсорбционной трубки помещается сначала плотная ватная пробка, затем насыпается адсорбционный порошок и тщательно утрамбовывается точно подобранной стеклянной или костяной палочкой. Весьма важно достичь гомогенного уплотнения адсорбирующего столбика, иначе адсорбционные зоны выявляются в виде неправильных образований, крайне затрудняющих механическое их разделение. Когда столбик адсорбента достиг желаемой высоты[3] (я применяю обычно 20 — 30 мм для маленькой и 40 — 50 мм для большой фильтрационной воронки), накладывается сверху вторая ватная пробка и наливается немного применяемого растворителя, чтобы пропитать им столбик адсорбента. После этого ватная пробка может быть снята. Если опустить предварительное пропитывание столбика, то часто случается, что при наливании в дальнейшем исследуемой жидкости верхние слои адсорбционного порошка — вероятно под воздействием развивающегося при смачивании тепла (Pouillet) — подымаются, переворачиваются под действием образующихся под ними пузырьков воздуха, и остатки их мешают правильному ходу хроматографии.

Фильтрование исследуемой вытяжки я веду под давлением в 250 — 300 мм, а при работе с большими адсорбционными воронками — при полной тяге водяного насоса. Пропустив определенное количество жидкости, переходят к фильтрованию чистого растворителя, причем отдельные адсорбционные зоны несколько расширяются и получают свою окончательную, максимальную дифференцировку. Неадсор- бирующиеся вещества вымываются целиком, а вещества, образующие с примененным порошком заметно диссоциирующие адсорбционные соединения, медленно спускаются вниз в виде колец и могут быть уловлены у концевого отверстия трубки, каждое отдельно от других.

Когда хроматограмма (обычно приходится иметь дело с окрашенными веществами) окажется окончательно дифференцированной, препарат освобождается от избытка растворителя положительным или отрицательным давлением так, чтобы он не расплывался, выталкивается из трубки и может быть расчленен ножом на намеченные участки.

Применение к анализу хлорофилла. Зеленый пигмент листьев, хлорофилл, является, как известно, смесью пигментов, сложность которой различными авторами оценивалась весьма различно. Задачей хроматографического анализа является окончательное установление степени этой комплексности. Метод этот по сравнению с другими играет ту же роль, как спектральный анализ при определении окраски по сравнению с анализом при помощи окрашенных стекол. Для получения пригодных вытяжек удобны способы:

  • 1. Экстракция растертого с тончайшим наждачным порошком нейтрализованного небольшим количеством MgO или СаС08 материала спиртсодержащим петролейным эфиром (1:10) и удаление спирта тщательной отмывкой дестиллированной водой (ср. Цвет, III). Отмывка эта должна быть произведена особенно тщательно, иначе оставшиеся следы спирта (и воды) образуют особые фазы на поверхности адсорбирующих частиц и хроматограммы получаются неясными.
  • 2. Экстракция растертых, предварительно несколько минут прокипяченных в воде, листьев при помощи чистого петролейного эфира. При этом образуются некоторые продукты распада.
  • 3. Экстракция растертых и нейтрализованных листьев при помощи ССНС) С14 или чистого CS2. Все пигменты переходят в раствор. Особенно можно рекомендовать как растворитель CS2.
  • 4. Экстракция растертых и нейтрализованных листьев спиртом, ацетоном, эфиром или хлороформом; отгонка растворителя в вакууме и растворение остатка в петролей- ном эфире или сероуглероде. При этом, однако, трудно избежать химических разложений. Можно также переводить пигменты из спиртового раствора (прибавив воды) непосредственно в петролейный эфир. Необходимо промыть водой.

Само собой разумеется, вся работа с хроматографией должна проводиться при возможном, отсутствии света, в особенности при работе с бензольными или сероуглеродными растворами. Получаемая из сероуглеродного раствора хроматограмма имеет следующий вид.

I. Самая верхняя зона. Бесцветная. Составляющее эту зону вещество (или смесь веществ) при Краусовском разделении является гипофазным (остается преимущественно в нижней фазе).

II. Зона, не резко отграниченная от следующей. Желтая, окрашенная ксантофиллом (i. Этот пигмент при Краусовском разделении переходит в нижнюю фазу.

1

Характерные полосы поглощения спиртового раствора: 474 — 462 и 445 — 430 у у.. Спиртовой раствор быстро окрашивается в синий цвет даже от следов соляной кислоты. Этот пигмент можно изолировать, пропуская через хроматограмму, петролейный эфир, содержащий 1% спирта. Все пигменты, кроме ксантофилла р, быстро вымываются; последний же легко освобождается промыванием петролейным эфиром с примесью 10% спирта.

III зона. Темнооливково-зеленая. Хлорофиллин р. При Краусовском разделении переходит в верхнюю зону (эпи- фазно). Основное поглощение света петролейного раствора 450—465, а в спиртовом растворе 460—475 уу. Вторая по интенсивности полоса поглощения при 640—650 уу (в петро- лейном эфире) и третья при 580—600 уу.

Хлорофиллин Р открыт был еще Сорби (1875), а не Мархлевским и Шунком, как ошибочно утверждается некоторыми новыми авторами (Чапек, Коль I, 139, Страсбур- гер, 656).[4] Саксе (стр. 332), работавший по способу Крауса, отметил также красную полосу поглощения этого хлоро- филлина, но приписал ее ксантофиллу. С своей стороны я проверил в 1901 г. опыты Сорби (Цвет, II). Аргументация Сорби была вполне правильна; Мархлевский и Шунк лишь повторили его опыты, равно как и химические работы Гартлея, я что касается опытов Сорби, то они повторили их совершенно неудачно, не получив достаточно чистых веществ и не обнаружили фактические адсорбционные соотношения хлорофиллинов а и (4 в сине-фиолетовой части спектра. Вторая их ошибка, касающаяся хлорофиллина (4, это их утверждение, будто этот пигмент находится в листьях в сравнительно незначительных количествах и не играет сколько-нибудь заметной роли в адсорбционном спектре общего хлорофильного раствора (Мархлевский и Шунк, 11, 258, Коль I, 139). Один взгляд на мои хроматограммы показывает, что хлорофиллин [4 сопровождает хлорофиллин а далеко не в малых количествах. С другой стороны, 1 полоса поглощения в сине-фиолетовой части спектра хлорофильной вытяжки принадлежит главным образом хлорофиллину (4, как это ясно из щелочной пробы Прейера (стр. 50) и красивых опытов с флуоресценцией Хагенбаха. Если синяя полоса поглощения хлорофиллина (4 в. спиртовом растворе лежит при 460—475 то в живом листе, нужно думать,

она совместится с линией F, и именно этому пигменту, а не каротину, нужно приписывать отмеченный Энгельманном, а затем и Колем (III) второй ассимиляционный максимум при F IV Зона. Темносине-зеленая. Окрашена хлорофиллом я (синим хлорофиллом Сорби). Немного примешанного ксантофилла можно удалить по Краусу. Эпифазна. Не обладает адсорбцией в синей части спектра, но дает полосу поглощения при 440—430 [Ар (в петролейном эфире) и вторую в фиолетовой части спектра. Этот пигмент был получен Сорби в 1875 г. в достаточно чистом виде.[5] Мною он был получен в кристаллическом виде (1, 1900). Замечание

Чапека (стр. 464), что мои кристаллы могут быть филло- цианином, совершенно не обосновано. Как известно, филло- цианин имеет синюю окраску только в растворе с НО, в спирту, эфире, петролейном эфире он обладает спектром хлорофиллана. Удивительно, как крепко укоренилось предвзятое представление, что в хлорофилле должен присутствовать зеленый пигмент.

V Зона. Желтая (ксантофиллы а' и а").

VI Зона. Бесцветная.

VII Зон а. Оранжево-желтая (ксантофилл а).

Обусловлена ли VI зона наличием какого-либо бесцветного вещества или образуется лишь благодаря перемещению VII зоны (см. выше в обоснованиях метода), я пока не могу сказать. Если пропускать через хроматограмму бензол, то VII зона быстро передвигается вниз и может быть уловлена у отверстия воронки. Зона же V передвигается медленно, распадаясь при этом на двойное кольцо. Следовательно, в ней находятся два вещества. Все эти ксантофиллы я предлагаю обозначать буквою а с показателями. Две первых, хорошо выраженных полосы поглощения ксантофилла а лежат при 485—470 и 455—440 (в алкогольном или петролейно-эфирном растворе). Полосы ксантофилла а' и a* лишь немного сдвинуты к ультрафиолетовой части спектра.

Ксантофиллы а гипофазны, и их спиртовой раствор под воздействием небольших количеств соляной кислоты не синеет, а обесцвечивается.

Если примененный для хроматографии раствор хлорофилла был в соприкосновении с кислотой, то в хроматограмме появляется еще VIII зона, серого цвета, быстро вымываемая бензолом и образуемая дериватом хлорофиллина (хлорофиллан а). Наконец, в прошедшей насквозь при хроматографии жидкости (в нашем случае с сероуглеродом) находится каротин, окрашивающий ее в оранжево-красный цвет. Каротин характерно эпифазен. Его спиртовой раствор под воздействием кислоты (соляной), даже крепкой, не окрашивается в синий цвет.[6] Полосы поглощения сероуглеродного раствора: 525—510, 490—472 и очень слабая при 460—455 |ijt. В петролейном эфире первые полосы лежат при 492—475 ^ и 460—445

Возникает теперь вопрос, не может ли хроматографический метод быть использован, как хроматометртгский. Весьма подкупала бы возможность выражать количество пигментов просто объемами насыщенного ими адсорбента. Опыты, которые я поставил в этом направлении, не привели, однако, до сих пор к удовлетворительным результатам. Благодаря взаимному воздействию отлагающихся пигментов окрашенные зоны не достигают одинаковой степени насыщения; наиболее выгодно в этом отношении поведение хлорофиллина а.

Ближайшие данные о выделенных мною хлорофиль- ных пигментах и их дериватах я сообщу в течение года в более обширной работе.

Капиллярный анализ. Считаю уместным посвятить здесь несколько слов так называемому, по Гоппелсредеру, капиллярному анализу, тем более, что этот автор в последнее время (II, 239) называет его адсорбционным анализом. Как известно, капиллярный анализ основан на эмпирическом, широко использованном, наблюденном впервые Шенбейном, свойстве компонентов раствора с различной скоростью подыматься по листу фильтровальной бумаги. По утверждению Оствальда (стр. 1097) в явлении играют роль адсорбционные силы; необходимо, однако, принять в расчет и диффузионные факторы (Фишер и Шмидмер), а также, при капилляризации спиртовых растворов, и ряд других моментов: накопление растворенного вещества вследствие испарения растворителя, осаждение вследствие адсорбции паров воды из воздуха или (при содержащих воду растворах) преобладающего испарения спирта и связанного с ним уменьшения концентрации его. Указанные обстоятельства, наряду с химическими воздействиями (окислениями воздействием кислот), должны быть приняты во внимание при учете наблюдаемых Гоппелсредером пигментных диф- ференцировок при производимой им капилляризации спиртовых вытяжек из различных растительных органов. Я поставил опыты с капилляризацией спиртовых вытяжек зеленых листьев. Безводные растворы не дают никаких диф- ференцировок (ср. Мюллера). Содержащие воду вытяжки дали мне следующую картину: сверху бесцветную зону, затем желтый пояс; зеленую зону, желтую (с намеком на зеленую окраску) и затем далее книзу у самого хлоро- фильного раствора бледнозеленую зону, которую можно получить при вынимании погруженного в раствор куска бумаги. При накладывании бумажной полоски на синюю кобальтовую бумагу верхние зоны, включая и желтый пояс, оказались сильно обводненными. При помещении высушенной бумажной полоски в петролейный эфир выяснилось, что желтый пояс окрашен ксантофиллами, так как он не обесцвечивается (как и зеленая зона); нижняя желтая зона, наоборот, быстро исчезала (каротин). Объяснение указанных капиллярных дифференцировок не представляет затруднений. Вблизи поверхности спиртового раствора хлорофилла идет особенно сильное испарение алкоголя, т. е. прогрессирующее уменьшение концентрации спирта в растворителе, и различные пигменты переходят в осадок по степени их нерастворимости в слабом спирте; сначала каротин, потом оба хлорофиллина вместе и, наконец, ксантофиллы. Ясно, таким образом, что капиллярный анализ спиртовых растворов не основан на адсорбции и нужно, чтобы не смешивать различные вещи, термин адсорбционный анализ оставить за разработанной мною методикой. Этим, само собою разумеется, не умаляется значение капиллярного анализа, так как хроматографический метод применим только к таким веществам, которые растворимы лишь в определенных жидкостях, вроде петролейного эфира, бензола, сероуглерода, четыреххлористого углерода и т. п.

ЛИТЕРАТУРА

Б е m m е J е n, J. М. van. Ztschr. f. anorg. Chemie, 23 (1900), S. 321.

C z a p e k, Fr. Biochemie der Pflanzen, 1 (1905).

Fischer, F. und Schmidmer, Ed. Liebig’s Ann., 272 (1893), S. 151. G о pp e 1 s г о e d e r, Fr. 1. Verhandl. der Naturf. Ges. Basel, 14 (1901).

II. Anregung zum Studium der Kapillaranalyse. Basel. 1906. Hagenbach, Ed. Poggend. Ann., 141 (1870), S. 245.

Hartley, W. N. Journ. of Chem. Soc., 39 (1891), S. 106.

Kohl, F. 1. Untersuchungen iiber das Karotin. Leipzig, 1902. 11. Ber. d.

deutsch. Bot. Ges., 24, S. 124. III. Ibid., 24,, S. 222.

Marchlewskl, L. und S chunk, С. A. I. Journ. Chem. Soc. 27 (1900),

S. 1081. II. Journ. f. prakt. Chemie, 62 (1900), S. 247.

Muller, N. J. C., Pringsh. Jahrb. f. wiss. Botanik, 7 (1869), S. 200. О s t w a 1 d, W., Lehrbuch der. allg. Chemie, 1 (1903).

Preyer, W., Die Blutkristalle, Jena, 1871.

Sachsse, R., Chemie und Physiologle der Farbstoffe, Leipzig. 1877. Sorby, H., Proc. Roy. Soc., London, 21 (1873), p. 442.

Strasburger, Ed., Das botanische Praktikum, IV Aufl. (1902).

Tswett, M., I. Compt. rend., 131 (1900), p. 842. II, ibid, 132 (1901), p. 149. III. Bor. d. deutsch. bot. Ges., 24 (1906), S. 316.

  • [1] См. рисунки таблицы I в нашем издании (стр. 204) — Ред.
  • [2] 2 Для этого удобно пользоваться шлемами от стеклянных приборчиковФрейденрейха, которые обычно применяются в бактериологии.
  • [3] Высокие столбики замедляют фильтрование. Но при слишком небольших высотах столбика может случиться (если пропускается много пигментного раствора), что отдельные окрашенные зоны пройдут насквозь, чтовпрочем в некоторых случаях бывает желательным.
  • [4] Данные эти основываются, конечно, на изложении вопроса Мархлевским и Шунком в их немецкой статье (II). Читатель, не знакомыйс образцовой работой Сорби (до последнего времени совершенно забытой),легко может составить себе представление, что работа была произведенапо методу разделения Сорби. Но сама работа Сорби ни разу даже не процитирована. Ясно, что указанные авторы не могли чать никаких новыхдоказательств наличия и предсуществования хлорофиллина р. В их английском сообщении (1) вопрос изложен более правидьна
  • [5] Когда Коль (1, 156), доверяясь Мархлевскому и Шунку, обозначаетих методику получения чистого .хлорофилла* (хлорофиллина а) новой,он впадает в ошибку. Методика эта, с весьма несущественными изменениями, повторяет старую методику Сорби. Во всяком случае Мархлевский и Шунк не имели в руках чистого хлорофиллина а. Присутствие 1 полосы поглощения позади F говорит, что препаратзаключал примесь хлорофиллина
  • [6] Противоположные данные Коля (II, 128) основаны на смешениинастоящего каротина с ксантофиллами. Раствор каротина в 70о/0 спиртавполне обесцвечивается бензином. То, что здесь Коль считал за каротин,было и могло быть (согласно процессу приготовления) только смесьюкаротина со всеми ксантофиллами, которые, как мы уже отмечали,являются гипэфазными.
 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >