Хроматографический метод

Хроматографические приборы. Для хроматографического анализа необходимы приборы различного типа в зависимости от того, желательно ли только обнаружить состав имеющейся в растворе смеси пигментов или же требуется отделить последние для ближайшего исследования либо для количественного определения.

Для первой цели пригоден прибор, изображенный на табл. 1, рис. 1, с помощью которого можно в течение нескольких минут произвести качественный анализ сложной смеси. Соединенная с манометром М склянка R (в'ести- мостью в 3 л) служит резервуаром давления, в который через стеклянную трубку D, посредством резиновой груши Р, можно накачать воздух.

Нагнетательная груша Р может герметически разобщаться от остальных частей прибора посредством зажима Q. Трубка D, укрепленная концами на деревянном штативе, играет роль дистрибутора давления; она снабжена некоторым количеством боковых узких ветвей, на которых укрепляются фильтрационные воронки. Рис. 2 табл. 1 изображает такую воронку. Последняя состоит из цилиндрического либо выпуклого резервуара г, нижняя часть которого вытягивается в виде цилиндрической трубки / (длина 30—40 мм, диам. 2—3 мм). Кончик последней несколько сплавляется, с целью сужения выходного отверстия и образования опоры для адсорбента, который помещается в трубке. В качестве фильтрационных воронок удобно употреблять шлемики известных в бактериологии стеклянок Фрейденрейха. Фильтрационная воронка прикрепляется к дистрибутору давления D посредством членика, изображенного на рис. 3 и состоящего из пробки, плотно входящей в отверстие воронки, стеклянной трубки, проходящей через пробку, и резиновой смычки, могущей замыкаться зажимом. Такой способ соединения фильтрационных воронок с аппаратом обеспечивает необходимую подвижность. Под фильтрационными воронками помещаются скляночки, служащие приемниками для фильтратов.

Описанный прибор, благодаря незначительному диаметру столба адсорбента, весьма пригоден для быстрого анализа небольшого количества пигмента.

Для количественного же определения пигментов, или для получения последних в значительном количестве, приходится иметь дело с адсорбционными столбами больших размеров, причем фильтрацию удобнее тогда производить под отрицательным давлением, пользуясь воздушным водоструйным насосом. Увеличение массы адсорбента должно происходить преимущественно за счет диаметра адсорбционного столба, так как увеличение высоты сопряжено с нежелательным замедлением фильтрационного тока. Но зато, чем больше площадь поперечного сечения адсорбционного цилиндра, тем труднее достичь равномерности тока на протяжении всего сечения, и адсорбатные зоны, вместо того чтобы разграничиваться плоскостями, отделяются друг от друга изогнутыми поверхностями, что подчас очень затрудняет механическое их разделение. Поэтому применяемые мною адсорбционные трубки не превышают в диаметре 30 мм. Рис. 1 табл. II изображает прибор для хроматографии больших количеств пигментных растворов.

Исследуемый пигментный раствор наливается в резервуар R, откуда он поступает в цилиндр А с адсорбирующим порошком и вытекает в толстостенную склянку V, соединяемую посредством боковой трубки с воздушным насосом.

Выбор адсорбента. Применяемый для хроматографического анализа адсорбент должен быть вполне нейтральным веществом по отношению к исследуемым пигментам, т. е. в пределах длительности анализа их не изменять. Он должен быть достаточно мелкозернист, чтобы при небольшом объеме поглощать значительное количество пигментов и чтобы можно было обеспечить полноту поглощения, плотно утрамбовав порошок и таким образом сузив в достаточной мере пространства между зернышками, образующими капиллярную систему, по которой фильтруется анализируемый раствор. Упомянутым требованиям вполне удовлетворяет, по крайней мере, относительно пигментов хлорофилла, осажденный углекислый кальций (calcium саг- bonicum praecipitatum).[1] Слабая щелочная реакция, устанавливающаяся в капиллярном слое влаги на поверхности крупинок названного адсорбента (ср. Emich), не оказывает влияния на адсорбированные хлорофиллины даже в течение 4 дней, о чем свидетельствует сохранение хлорофиллинами растворимости в углеводородах и спектральных свойств. С целью контроля можно применять в качестве адсорбентов инулин, или обыкновенный сахар, тщательно растертый в ступке. Хроматограммы на сахаре, впрочем, не так отчетливы, как углекальциевые.

Выбор растворителя. В силу соображений, приведенных раньше (стр. 62), петролейный эфир—эта смесь пентана, гексана и нескольких высших гомологов, представляется наиболее рациональным растворителем (средой адсорбции). К сожалению, не все ныне известные красящие вещества спирторастворимой группы фотосинтезных пигментов растворяются в петролейном эфире. Так, например, хлоро- филлин ? из бурых водорослей совершенно не растворяется в данной жидкости, и даже хлорофиллины t и Р растворяются в ней, как будет показано впоследствии, только благодаря присутствию особого постороннего вещества.

Сероуглерод и бензол имеют то преимущество, что они непосредственно извлекают из растираемых в них свежих листьев совокупность пигментов, почему полученные растворы, после фильтрации через бумагу, прямо годятся для хроматографии; между гем как петролейно-эфирные экстракты, получаемые только под условием прибавления к растворителю спирта, должны быть сперва тщательно отмыты от последнего водою. Производить эту промывку, просто встряхивая экстракт с водою, нецелесообразно, так как при этом возникает, главным образом в водяном слое, очень устойчивая эмульсия, обусловленная выпадающим из петро- лейно-эфирного раствора коллоидальным веществом и удерживающая некоторое количество пигмента. Для быстрого удаления спирта экстракт помещается в колбе Эрленмейера над двойным объемом дестиллированной воды; осторожным вращением колбы обе жидкости приводятся в движение, обеспечивая быструю диффузию спирта из экстракта в воду. Затем через две минуты вода удаляется посредством пипетки или сифона и заменяется свежей; по двукратном повторении этого приема концентрация остающегося в экстракте спирта настолько ничтожна, что последний уже не препятствует адсорбции и правильности расслоения пигментов.

Наиболее удобно, однако, производить отмывание спирта при помощи изображенного на табл. 1 рис. 4 прибора. Последний состоит из широкого, конической формы, сосуда (например склянки Гайона), замыкающегося посредством пробки, через которую проходят две трубки а и Ь. Одна из них, прямая (а), доходит почти до дна сосуда, другая, изогнутая под прямым углом (b), выступает лишь на несколько миллиметров из-под пробки. К наружным концам обеих трубок прикреплены короткие отрезки резиновой трубки. В сосуд наливается подлежащий промыванию петролейно- эфирный экстракт, вставляется пробка и через трубку а вводится дестиллированная вода. При значительной площади соприкосновения обеих жидкостей переход спирта из пет- ролейного эфира совершается быстро и ускоряется еще вращательным движением, в которое время от времени рукой приводится содержимое склянки. Образование в водяном слое, при движении, особого рода струек („Schlieren") делает переход этот заметным глазу. По истечении двухтрех минут промывная вода переменяется, для этого резиновая смычка на конце трубки b замыкается зажимом или просто сжимается пальцами, и весь сосуд опрокидывается вверх дном, после чего воде дают вытекать через трубку Ь. Благодаря форме сосуда, промывную воду можно удалить почти совершенно, оставляя лишь тонкий слой, предохраняющий раствор от соприкосновения с пробкой.

Когда вся вода стекла, трубка b вновь замыкается, сосуд ставится в прежнее положение, и в него вновь вводится вода. Полного очищения экстракта от спирта этилового достигаем в два приема, промывая каждый раз приблизительно двойным объемом воды. Метиловый спирт отмывается еще быстрее.

При отмывании из него спирта петролейно-эфирный экстракт хлорофилла всегда несколько мутнеет, очевидно, вследствие выпадения из него некоторых веществ, удерживающихся в растворе благодаря присутствию спирта. Для удаления мути промытый экстракт фильтруется через двойной бумажный фильтр.

Уже было упомянуто, что хроматограммы хлорофилла, получаемые из петролейно-эфирных растворов последнего, несовершенны в смысле неполноты обособления отдельных веществ. Зоны верхние содержат примеси веществ, принадлежащих зонам, лежащим ниже. Пропускание через хроматограмм тока чистого растворителя не ведет к более полному разъединению вещества вследствие практически полной адсорбции, или, иначе говоря, недиссоциируемосги адсорбционных соединений в данном растворителе. Иначе обстоит дело с хроматограммами из сероуглеродного или бензольного растворов. Адсорбционные зоны, уже при отложении их во время фильтрации, получаются более чистыми: ксантофиллы не налегают на хлорофиллин а, хлорофиллины не удерживаются в верхнем бесцветном слое. Кроме того при пропускании через хроматограммы тока сероуглерода или бензола происходит заметной скорости миграция зон, ведущая к большему их обособлению. Последним свойством сероуглерода и бензола можно воспользоваться для .проявления” хроматограмм, полученных из петролейно-эфирных растворов.

Особенно отчетливые хроматограммы на СаС03 получаются из сероуглеродных растворов (ср. стр. 123) или при пропускании сероуглерода через хроматограммы петролейно- эфирного происхождения. Из бензольного раствора ксантофиллы а и а' получаются в виде очень бледных, расплывчатых зон; хлорофилланы же совсем не адсорбируются, точно так же как и каротин. Последний не адсорбируется тоже и из сероуглеродного раствора.

Как видно из предыдущего, различные растворители имеют, в качестве среды адсорбции, каждый свои преимущества и недостатки и каждый свою сферу применения.

Техника хроматографического анализа. Узкие адсорбционные воронки наполняются адсорбентом следующим образом. Сперва суженный кончик трубки снабжается маленькой ватной пробкой, которая вводится со стороны резервуара и вталкивается посредством стеклянной палочки, плотно входящей в трубку. В резервуар всыпается затем адсорбент, вводится с помощью упомянутой палочки в трубку и тщательно утрамбовывается в ней, чтобы придать адсорбционному столбу плотную, однородную текстуру. Последнее весьма существенно в виду обеспечения через столб равномерной фильтрации. В противном случае адсорбционные зоны разграничиваются извилистыми плоскостями и обладают неравномерной толщиной.

Для заряжения больших адсорбционных цилиндров в суженное горлышко их вставляется сперва ватная пробка, сверх которой всыпается трехсантиметровый слой песку и утрамбовывается деревянным шомполом. Затем всыпается адсорбент и также тщательно утрамбовывается. Высота столба уплотненного адсорбента (СаС03) не более 80 мм, дабы не слишком замедлить скорость фильтрации через него растворов. Прослойка песку имеет целью образование плотного, не поддающегося во время утрамбовки, субстрата для адсорбента.

Фильтрация исследуемых растворов производится в маленьком аппарате при манометрическом давлении в 250-300 мм ртути. Перед тем как вливать в вороночку раствор, небесполезно вдавить в адсорбционную трубку маленький тампон ваты и влить несколько капель растворителя с целью пропитать верхние слои адсорбента, после чего вату можно снять. Иначе может зачастую случиться, что при вливании в воронку испытуемого раствора поверхностный слой адсорбента, вероятно вследствие выделяющейся при смачивании теплоты Pouiiiet, вдруг приподнимается и опрокидывается образовавшимся под ним пузырем воздуха, и обломки его, ложась на поверхность столба адсорбента, мешают правильному ходу хроматографического расслоения.

При работе с большими адсорбционными цилиндрами последние соединяются сначала с вакуум-аппаратом, и только после приведения его в действие вливается исследуемый раствор.

Пропустив через столб адсорбента желаемое количество раствора, полученную хроматограмму подвергают окончательному „проявлению' посредством пропускания через него тока чистого растворителя. В качестве проявителей для хроматограмм хлорофилла особенно пригодны, как мы видели, сероуглерод и бензол. Так как в последнем миграция ксантофилловых (а и а') слоев очень быстра, то при достаточно продолжительном пропускании бензола можно легко вымыть из адсорбционного столба эти ксантофиллы и получить их отдельно в виде бензольных растворов.

Когда при „проявлении1* адсорбционные зоны достаточно разъединились, дальнейший приток растворителя прекращается; если последним был сероуглерод или бензол, то, для вытеснения его с поверхности адсорбента, пропускается петролейный эфир, а затем прогоняется воздух (или светильный газ), который вытесняет из капиллярных пространств столба адсорбента наполняющую их жидкость.

Адсорбционный столб в силу этого приобретает некоторую связность, почему его возможно вытолкнуть из прибора в виде белоснежного расцвеченного разноцветными полосами цилиндра. Последний кладется на глянцевитую бумагу, и отдельные зоны немедленно посредством скальпеля отрезываются, после чего пигменты извлекаются из них спиртом, эфиром или петролейным эфиром с примесью спирта. В случае если две окрашенные зоны соприкасаются непосредственно и разграничивающая их плоскость является извилистой, отделение обеих зон начисто — затрудительно;. приходится тогда пожертвовать пограничными слоями их обеих.

  • [1] Крупинки этого препарата угловатые либо округленные, среднимдиаметром в 0.005 см. Предполагая все частички сферическими, указанного диаметра и принимая удельный вес СаСОз равным 2.8, вычисляется для 1 грамма порошка общая площадь поверхности 428 см2.
 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >