Меню
Главная
Авторизация/Регистрация
 
Главная arrow Техника arrow БИОТЕХНИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ
Посмотреть оригинал

Принципы проектирования БТС для анализа РНК и ДНК на основе полимеразной цепной реакции

Определение целевого назначения и класса проектируемой БТС для анализа рибонуклииновых (РНК) и дезоксирибонуклеиновых (ДНК) кислот. Такие системы относят к классу БТС для лабораторной диагностики, основанных на физико-химических методах (см. рис. 12.1) и зондировании биообъекта путем взятия биопроб - тест-ткансй.

Цель проектирования - разработка автоматизированного анализатора ДНК и РНК для определения специфических молекул РНК и ДНК в биопробах в присутствии миллионов других молекул. По результатам анализа РНК и ДНК осуществляют подбор пар донор - реципиент при трансплантациях органов и тканей, детекцию сопутствующих инфекционных патологий, генодиагностику различных заболеваний, идентификацию личности. При этом важными требованиями являются автоматизация проведения ПЦР и анализа продуктов, а также уменьшение времени определения.

Для исследования ДНК в биопробе, взятой для анализа, наиболее часто применяют три метода: цитогенетический анализ; блот- гибридизация по Саузерну - саузерн-блот (southern-blot); метод ПЦР (polymerase chain reaction, РСК).

Цитогенетический анализ используют для выявления крупных хромосомных аномалий, затрагивающих обширные области генома. Классический цитогенетический анализ - это относительно доступный метод вследствие умеренной стоимости, относительной простоты и, главное, достаточного числа соответствующих лабораторий и специалистов.

Саузерн-блот позволяет оценить число копий конкретного гена в клетках (обнаружить амплификации и делеции), а также идентифицировать генные перестройки. Искомые фрагменты ДНК определяют методом радиоавтографии на электрофореграммах. Саузерн-блот - очень информативный метод, практически не дающий ошибочных результатов. Однако его применение в клинической практике весьма ограниченно вследствие высокой стоимости, сложности и многоэтапное™ процедуры, а также несовершенства «нерадиоактивных» протоколов определения нуклеотидных последовательностей.

Метод ПЦР, безусловно, завоевал звание чемпиона методик молекулярной медицины. Хотя с момента его разработки прошло чуть более 10 лет, без него не обходится ни одна современная онкологическая клиника. Метод ПЦР применяют не только для уточненной диагностики неоплазм, но и для подбора пар донор - реципиент при трансплантациях органов и тканей, детекции сопутствующих инфекционных патологий и др. В отличие от сау- зерн-блота, метод ПЦР менее пригоден для оценки макроструктуры гена, но является уникальным подходом к детальному анализу отдельных его фрагментов.

Метод ПЦР имитирует естественную репликацию ДНК, и позволяет обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул.

Открытие ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии XX в. Это дало возможность поднять медицинскую диагностику на качественно новый уровень.

Впервые состав ингредиентов, входящих в реакционную смесь для постановки ПЦР, и основные принципы использования праймеров (коротких искусственно синтезированных молекул ДНК) для получения копий ДНК были описаны X. Клеппе и соавторами в 1971 г. Однако тогда еще не было продемонстрировано основное свойство ПЦР - экспоненциальное увеличение числа копий фрагмента исходной ДНК в ходе реакции.

В 1983 г. сотрудник фирмы Cetus К. Маллис предложил метод, ставший в дальнейшем известным как ПЦР. Суть этого метода заключается в многократном копировании (амплификации) в пробирке определенных фрагментов ДНК в повторяющихся температурных циклах. В каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой.

Следует отметить, что этому открытию сопутствовало развитие новых технологий, в частности появление приборов, позволяющих автоматически синтезировать фрагменты ДНК - олигонуклеотиды. В этот же период были обнаружены уникальные микроорганизмы, живущие в гейзерах. Их ферментная система (ДНК-полимераза) выдерживает высокие температуры горячих источников и сохраняет свою биологическую активность вплоть до 95 °С, что является необходимым условием для проведения ПЦР.

Результатом открытия ПЦР стало почти немедленное практическое применение метода. В 1985 г. Р.К. Сайки и другие ученые опубликовали статью, в которой была описана амплификация геномной последовательности Р-глобина. С этого момента количество публикаций, в которых авторы сообщали о применении ПЦР в своих работах, увеличивалось в геометрической прогрессии. Метод настолько популярен, что в настоящее время уже трудно представить работу в области молекулярной биологии без его использования. Особенно бурное развитие метод ПЦР получил благодаря международной программе «Геном человека». Были созданы современные лазерные технологии сиквенирования (расшифровки нуклеотидных последовательностей ДНК). Если в недавнем прошлом для расшифровки последовательности ДНК размером 250 пар нуклеотидов требовалась неделя, то современные лазерные сикве- наторы позволяют определять до 5000 пар нуклеотидов в день. Это, в свою очередь, способствует значительному росту информационных баз данных, содержащих нуклеотидные последовательности ДНК. В настоящее время предложены всевозможные модификации метода ПЦР, показана возможность создания тест-систем для обнаружения микроорганизмов, выявления точечных мутаций, описаны десятки различных применений метода.

По данным журнала LabMedica International, с 1995 г. наблюдается увеличение расходов на ПЦР-диагностику, что является показателем роста использования метода ПЦР в практической медицине. Ученые США отмечают, что в 1996 г. на ДНК- диагностику было потрачено 180 млн долл., к 2003 г. затраты возрасли до 1400 млн долл.

В настоящее время по данным того же журнала наиболее быстро развиваются пять основных направлений ДНК-диагностики:

  • • инфекционных заболеваний;
  • • онкологических заболеваний (лейкемий и лимфом, рака груди и др.);
  • • генетических заболеваний;
  • • идентификация личности (судебная медицина, криминалистика; трансплантация органов и тканей; определение отцовства);
  • • патогенных микроорганизмов в пище.

Главное направление развития рынка систем ДНК-диагностики - диагностика инфекционных заболеваний.

В отличие от иммуноферментного анализа (ИФА), который широко используют для диагностики инфекционных заболеваний, ДНК-диагностика позволяет определять непосредственно возбудителя заболевания. С помощью усовершенствованных схем проведения ПЦР можно выявлять патогенные микроорганизмы только в очень низкой концентрации.

ДНК-диагностика рака ограничивается небольшим, но активно возрастающим количеством сведений о генах, ассоциированных с раком. В рамках программы «Геном человека» ученые продолжают поиски мутаций, ассоциированных с этим типом заболеваний.

ДНК-диагностика генетических заболеваний, также как и раковых, может развиваться только вслед за проведением широких научных исследований генома человека. Медицинское сообщество уже осознало важность изучения генетической основы заболеваний, а также возможности диагностирования и начала лечения болезни до проявления ее симптомов.

Эксперты оценивают системы идентификации личности на рынке систем ДНК-диагностики как одно из наиболее крупных и быстрорастущих направлений. Ожидаемый ежегодный прирост в этом секторе составляет 20 %.

В настоящее время сектор рынка систем ДНК-диагностики патогенных микроорганизмов в пище является самым скромным. На ДНК-диагностику микробного загрязнения производимых продуктов питания приходится менее 5 % от общего числа методов, применяемых для тестирования загрязненности продуктов (культуральные методы и методы с использованием моноклональных антител). По оценкам экспертов, ДНК-диагностика - более быстрый, точный и информативный метод, что приведет к резкому возрастанию доли данного сектора рынка.

Создание базы данных о свойствах биообъекта. Молекулы ДНК и РНК содержат четыре основания: пиримидиновые (цитозин С, тимин Т) и пуриновые (гуанин G, аденин А) (рис. 12.16). Эти основания входят в нуклеотиды, последовательное соединение которых образует полимерные молекулы ДНК и РНК (лестница фрагментов нуклеиновых кислот). Подобно белкам, ДНК имеет первичную, вторичную и третичную структуры.

Структура олигонуклеотидных фрагментов ДНК - пары оснований, связанные водородными связями (принципы комплементар- ности Чаргаффа)

Рис. 12.16. Структура олигонуклеотидных фрагментов ДНК - пары оснований, связанные водородными связями (принципы комплементар- ности Чаргаффа)

В нуклеотидной последовательности молекул ДНК закодирована генетическая информация. Каждая биологическая особь обладает своим индивидуальным набором молекул ДНК. Таким образом, нуклеотидая последовательность в молекуле ДНК ее полностью определяет. Аналогично нуклеотидая последовательность полностью определяет молекулу РНК.

Основные функции ДНК - обеспечение воспроизводства самой себя в ряду клеточных поколений и поколений организмов;

обеспечение синтеза белков.'Эти функции ДНК обусловлены тем, что в первом случае молекулы ДНК служат матрицей для репликации, т. е. копирования информации в дочерних молекулах ДНК, а во втором - для транскрипции, т. е. для перекодирования информации на структуру РНК.

Метод ПЦР относится к методу амплификации (копирования) ДНК в пробирке (/'и vitro), с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить число определенных фрагментов ДНК в миллиарды раз. Возможность получения огромного количества копий одного строго определенного фрагмента генома значительно упрощает исследование имеющегося образца ДНК.

Вначале для проведения ПЦР необходимо подготовить реакционную смесь, содержащую праймеры, Taq-полимеразу, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), буфер.

Праймеры - пара искусственно синтезированных олигонуклеотидов, имеющих размер 15...30 пар нуклеотидов, идентичных соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.

Taq-полимераза-термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание З'-конца второй цепи ДНК согласно принципу ком- плементарности (см. рис. 12.16).

Смесь дНТФ - дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ), дезокси- гуанозинтрифосфат (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфат (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфат (дТТФ) - «строительный материал», используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

Буфер - смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающих оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение показателя кислотности.

Метод ПЦР состоит из нескольких стадий (рис. 12.17).

На первой стадии перед амплификацией проводят выделение препарата ДНК из биопробы.

В зависимости от поставленных задач для выделения ДНК используют различные методики. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопробы и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки ПЦР. Иногда бывает достаточно про-

кипятить образец в течение 5... 10 мин, однако в большинстве случаев требуются более сложные методики.

Стадии метода ПЦР

Рис. 12.17. Стадии метода ПЦР:

а - выделение ДНК; б - амплификация и отжиг; в - детекция продуктов ПЦР в агарозном геле; У, 2 - положительные и отрицательные образцы; 3,4 - положительный и отрицательный контроль

Стандартной считается методика получения чистого препарата ДНК, описанная М. Мармуром. Методика включает в себя ферментативный протеолиз с последующей депротеинизацией и пере- осаждением ДНК спиртом. В результате можно получить чистый препарат ДНК. Однако эта методика довольно трудоемка и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ.

В настоящее время популярна методика выделения ДНК, предложенная А. Бумом и соавторами. Методика основана на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента - гуанидина тиоционата (GuSCN), и последующей сорбции ДНК на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное «молоко»). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также при многократных отмывках. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР. Поэтому при использовании данной методики очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов. Следует отметить, что в связи с большим количеством стадий добавления и удаления растворов при работе с образцом требуется аккуратность, так как возможна перекрестная контаминация между пробами образующимся аэрозолем ДНК.

Другая группа методик выделения ДНК основана на применении ионообменников типа Chilex, которые в отличие от стекла сорбируют не ДНК, а, наоборот, примеси, мешающие реакции. Как правило, эта технология включает в себя две стадии: кипячение образца и сорбцию примесей на ионообменнике. Методика чрезвычайно привлекательна простотой исполнения. В большинстве случаев она пригодна для работы с клиническим материалом. К сожалению, иногда встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, некоторые микроорганизмы не поддаются разрушению простым кипячением, вследствие чего необходимы дополнительные стадии обработки биопробы.

При массовом скрининге, когда важно получить статистические данные, возможно использование простых методик с применением детергентов или обработки биологического материала щелочами с последующей их нейтрализацией. В то же время подобные методики выделения ДНК для клинической диагностики могут дать ложноотрицательные результаты вследствие использования в реакционной смеси при амплификации некачественного препарата ДНК.

Таким образом, к выбору методики выделения ДНК следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов.

Вторая стадия метода ПЦР - амплификация (многократное копирование ДНК) (см. рис. 12.16).

Выделенный из биопробы препарат ДНК вносится в подготовленную реакционную смесь. Этот препарат может содержать исходную ДНК (например, ДНК микроорганизмов или человека), При отсутствии в препарате исходной ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется (рис. 12.18).

Условия наличия и отсутствия амплификации

Рис. 12.18. Условия наличия и отсутствия амплификации

Если в анализируемом образце присутствует исходная ДНК, то при амплификации с ДНК происходит ряд событий, обеспечиваемых определенными температурными циклами. Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов (см. рис. 12.16).

Первый этап - денатурация ДНК, находящейся в образце. Для этого реакционную смесь нагревают до 92...95 °С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.

Второй этап - отжиг. Слово «отжиг» происходит от английского металлургического термина annealing (охлаждение сплавов в определенном режиме). При отжиге праймеры присоединяются к одноцепочечной молекуле ДНК-мишени. Однако следует учитывать некоторые особенности отжига праймеров. Как правило, в анализируемом биологическом образце присутствуют разнообразные молекулы ДНК, к которым используемые в реакции праймеры имеют частичную, а в некоторых случаях значительную, гомологию. Кроме того, праймеры могут отжигаться друг с другом, образуя прай- мер-димеры. И то и другое приводит к значительному расходу праймеров на синтез побочных (неспецифических) продуктов реакции и соответственно к значительному уменьшению чувствительности системы. Это затрудняет или делает невозможным чтение результатов реакции при проведении электрофореза.

Праймеры выбирают так, что они ограничивают исходный фрагмент и комплементарны противоположным цепям ДНК. Отжиг происходит в соответствии с принципом комплементарное™ Чаргаффа: в двухцепочечной молекуле ДНК напротив аденина всегда находится тамин, а напротав гуанина цитозин (см. рис. 12.16).

Если это условие не соблюдено, то отжига праймеров не происходит (см. рис. 12.18).

Третий этап - элонгация (синтез) второй цепи ДНК. Фермент - Taq-полимераза - начинает достраивание второй цепи ДНК с З'-кон- ца праймера. Температуру в реакционной смеси доводят до температуры оптимума работы Taq-полимеразы, и синтез второй цепи продолжается с максимальной эффективностью. Иногда, в случае близости температуры отжига праймеров к температуре оптимума работы фермента, становится возможным использовать двухстадийный цикл ПЦР, совместив отжиг и элонгацию.

В дальнейшем этапы денатурации, отжига и элонгации многократно повторяются (30 и более раз). На каждом цикле число синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается (рис. 12.19).

Циклы удвоения числа синтезированных копий фрагмента ДНК

Рис. 12.19. Циклы удвоения числа синтезированных копий фрагмента ДНК

Результат циклического синтеза - экспоненциальное увеличение числа специфического фрагмента ДНК, которое можно описать формулой

где Аш - число специфических (ограниченных праймерами) продуктов амплификации; М - начальное число ДНК-мишеней; пш - число циклов амплификации.

По некоторым данным, фактическое значение эффективности отдельных циклов амплификации составляет 78...97 %. В случае присутствия в пробе ингибиторов реакции это значение может быть намного меньше, поэтому фактическое число специфических продуктов амплификации лучше описывает уравнение

где ?эф - значение эффективности реакции.

Следует отметить, что в процессе амплификации на исходной цепи синтезируются и длинные фрагменты (рис. 12.20), однако их накопление происходит в арифметической прогрессии:

где Кш - число длинных продуктов амплификации.

Таким образом, специфические фрагменты ДНК, ограниченные на концах праймерами, впервые появляются в конце второго цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации.

Необходимо также отметить, что накопление специфических продуктов амплификации в геометрической прогрессии происходит лишь ограниченное время, а затем его эффективность критически падает. Это связано с так называемым эффектом плато.

Термин «эффект плато» используют для описания накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации, когда количество ампликонов достигает 0,3... 1,0 пмоль.

В зависимости от условий и числа циклов амплификации на время достижения эффекта плато влияют утилизация субстратов (дНТФ и праймеров), стабильность реактантов (дНТФ и фермента), число ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы, конкуренция за реагенты неспецифическими продуктами или праймер-димерами, концентрация специфического продукта и неполная денатурация при высокой концентрации продуктов амплификации.

Стадии амплификации при проведении ПЦР

Рис. 12.20. Стадии амплификации при проведении ПЦР

Чем меньше начальная концентрация ДНК-мишени, тем выше риск достижения эффекга плато. Данный момент может наступить до того, как количество специфических продуктов амплификации будет достаточным, чтобы их можно было проанализировать. Избежать этого позволяют лишь хорошо оптимизированные тест-системы.

Третья стадия - детекция полученных продуктов (см. рис. 12.17).

Для визуализации результатов амплификации используют различные методики. В настоящее время наиболее распространена методика горизонтального электрофореза, основанная на разделении молекул ДНК по размеру. Для этого готовят пластину агарозного геля, представляющего собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в концентрации 1,5...2,5 % с добавлением специального красителя ДНК (например, бромистого этидия). Застывшая агароза образует пространственную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют специальные лунки, в которые затем вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального электрофореза и подключают источник постоянного напряжения. Отрицательно заряженная ДНК начинает премещаться в геле от минуса к плюсу, при этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияет концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав элек- трофорезного буфера и, в меньшей степени, нуклеотидный состав ДНК. Все молекулы одного размера перемещаются с одинаковой скоростью. Краситель встраивается (интеркалирует) плоскостными группами в молекулы ДНК. После окончания электрофореза, который продолжается от 10 мин до 1 ч, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне значений (254...310 нм).

Энергия ультрафиолетового излучения, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм).

Яркость свечения полос продуктов амплификации может быть различной, поэтому часто в ПЦР-лабораториях принято оценивать результат по трех-, четырех- или пятибалльной системе. Однако, как уже было отмечено ранее, это нельзя связывать с начальным количеством ДНК-мишени в образце. Часто уменьшение яркости свечения полос связано со снижением эффективности амплификации под влиянием ингибиторов или других факторов.

Методика вертикального электрофореза принципиально похожа на методику горизонтального электрофореза. Их отличие заключается в том, что в данном случае вместо агарозного геля используют полиакриламидные гели, которые помещают в специальной камере для вертикального электрофореза. Эта методика имеет большую разрешающую способность по сравнению с методикой горизонтального электрофореза, позволяя различать молекулы ДНК любых размеров с точностью до одного нуклеотида. Приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее агарозного. Кроме того, он является токсичным веществом. Поскольку необходимость определения размера продукта амплификации с точностью до одного нуклеотида возникает редко, в рутинной работе используют методику горизонтального электрофореза.

Другая методика детекции продуктов амплификации основана на гибридизации олигонуклеотидных зондов с продуктами амплификации, содержащими ту или иную метку. В этом случае применяют плашечный формат и систему детекции, аналогичную используемой в ИФА. Гибридизационные методики пока не получили широкого распространения вследствие их высокой стоимости, длительности и трудоемкости методических манипуляций. Однако они интересны с позиции массового скрининга, так как при наличии соответствующего оборудования могут быть легко автоматизированы.

Главное преимущество метода ПЦР - его уникальная чувствительность, поэтому он позволяет проводить не только диагностику, но и мониторинг эффективности лечения различных патологических процессов. Метод ПЦР относительно прост. Главное препятствие к его применению не стоимость ПЦР, а необходимость высочайшей культуры организации и исполнения этого метода. При несоблюдении стандартов метод может дать ложноположительные результаты. Ложноотрицательные результаты встречаются реже, хотя их появление также связано преимущественно с субъективными погрешностями.

Возможность использования РНК в качестве мишени для ПЦР существенно расширяет спектр применения этого метода. Например, геномы многих вирусов (гепатит С, вирус инфлюэнцы, пикорнавиру- сы и т. д.) представлены именно РНК, при этом в их жизненных циклах отсутствует промежуточная фаза превращения в ДНК. Для детекции РНК необходимо в первую очередь перевести ее в форму ДНК, для чего предназначены обратные транскриптазы, которые выделяют из параметров двух различных вирусов: Avian myeloblastosis virus и Moloney murine leukemia virus. Применение этих транскриптаз связано с некоторыми трудностями. Прежде всего, они термолабильны, поэтому могут быть использованы при температуре не более 42 °С. Поскольку при такой температуре молекулы РНК легко образуют вторичные структуры, эффективность реакции заметно снижается и по разным оценкам приблизительно равна 5 %. Предпринимают попытки обойти этот недостаток, используя в качестве обратной транскриптазы термостабильную полимеразу, которую получают из термофильного микроорганизма Thermus Thermophilus, проявляющего транскриптазную активность в присутствии Мп2+. Это единственный известный фермент, способный проявлять как полимеразную, так и транскриптазную активность.

Для проведения реакции обратной транскрипции в реакционной смеси, также как и при ПЦР, должны присутствовать праймеры (затравка) и смесь четырех дНТФ («строительный» материал). После проведения реакции обратной транскрипции полученные молекулы ДНК могут служить мишенью для проведения ПЦР.

Регуляризация (проверка правильности) метода ПЦР. Для оценки правильности результатов ПЦР важно понимать, что данный метод не является количественным. Теоретически продукты амплификации единичных молекул ДНК-мишени могут быть обнаружены с помощью электрофореза уже после 30...35 циклов. Однако на практике это выполняется лишь тогда, когда реакция проходит в условиях, близких к идеальным, что в реальности встречается не часто. Особенно большое влияние на эффективность амплификации оказывает чистота препарата ДНК, т. е. наличие в реакционной смеси тех или иных ингибиторов, избавиться от которых в некоторых случаях бывает крайне сложно. Иногда вследствие их присутствия не удается амплифицировать даже десятки тысяч молекул ДНК-мишени. Таким образом, прямая связь между исходным количеством ДНК-мишени и конечным количеством продуктов амплификации часто отсутствует.

Описание структуры и проектирование БТС. Важный фактор воспроизводимости амплификации — приборное обеспечение. Кроме надежности амплификатора и точности поддержания температур, следует упомянуть о гаком элементе прибора, как использование активного регулирования, позволяющего достигать необходимой температуры реакционной смеси внутри пробирки в значительно более короткие сроки, чем при обычном регулировании. Тем самым сокращается время реакции (в 1,5-2 раза), увеличивается время сохранения активности Taq-полимеразы, что повышает число циклов амплификации, снижает риск неспецифического отжига праймеров, а следовательно, повышает чувствительность и специфичность реакции.

К приборам такого класса относят аппараты фирмы Perkin- Elmer 2400 или 9600, HyBaid «TouchDown», MJ Research PTC200. Среди отечественных амплификаторов активное регулирование реализовано в термоциклере МС-2 («Терцик»), При использовании приборов с активным регулированием необходимо учитывать тип ПЦР-пробирок и строго придерживаться рекомендаций фирм-

изготовителей. Это объясняется тем, что при высоких скоростях изменения температуры минимальные отличия в конфигурации гнезд амплификатора и формы конуса ПЦР-пробирки могут сводить на нет преимущества активного регулирования и снижать чувствительность реакции вследствие температурных погрешностей, связанных с ухудшением теплового контакта.

Анализ вариантов электропневмомеханического оборудования для молекулярно-генетических исследований на основе ПЦР выявляет необходимые квалификационные признаки. Эти признаки позволяют разработать обобщенные модель расчета и расчетную схему БТС для проведения ПЦР.

Обобщенные модель расчета и расчетная схема дают возможность использовать единый подход к разработке математических моделей расчета электропневмомеханического оборудования для проведения ПЦР независимо от принципа действия и конструктивного исполнения, а также упростить расчетно-теоретическое моделирование такого оборудования.

С помощью обобщенных модели расчета и расчетной схемы конструируется целевая функция проекта БТС для анализа РНК и ДНК.

 
Посмотреть оригинал
< Предыдущая   СОДЕРЖАНИЕ   Следующая >
 

Популярные страницы