Е. coli-системы: плазмидные векторы

Существует много разных принципов классификации плазмид. Особого внимания заслуживает принцип, основанный на учете наличия в них модульных сегментов ДНК. В табл. 5.7 суммированы данные о модульных особенностях пяти природных плазмид. Каждый модульный сегмент может содержать один или несколько генов, или цис-действующих элементов, таких, например, как область инициации репликации.

Таблица 5.7

Молекулярная организация плазмид

Каждая плазмида должна иметь один или несколько модулей репликации, которые позволяют ей автономно реплицироваться. В одном из классов плазмид, представителями которого являются F-плазм иды, репликация и сегрегация регулируются согласованно с репликацией бактериального генома, и в каждой клетке содержится одна или две копии плазмиды. Такой тип репликации называют репликацией со строгим контролем. Второй тип модуля репликации свободен от такого контроля, что приводит к существованию в клетке многих копий плазмид. Он получил название модуля репликации с ослабленным контролем.

Модули еще одного типа содержат гены, белковые продукты которых инактивируют антибиотики. Плазмиды, несущие такие модули, часто называют R-плазмидами.

Некоторые плазмиды содержат также многие другие модули, кодирующие, например, системы рестрикции-модификации (система Eco RT).

Модули как подвижные элементы. Плазмиды, выделенные независимо и даже в организмах, обитающих в разных местах планеты, часто содержат близкородственные модули. На основании этих и других данных возникло представление о том, что между г еномами происходит обмен некоторыми генетическими модулями в виде интактных сегментов ДНК. В настоящее время доказано, что в бактериальных плазмидах происходит множество перестроек и обменов. Например, ^-плазмиды, присутствующие в клетках определенных бактерий, отличных от Е. coli, особенно в Salmonella typhimurium или Proteus mirabilis, могут диссоциировать на две отдельные плазмиды, каждая из которых содержит одну из двух ее частей. F-подобные последовательности образуют независимо реплицирующуюся конъюгативную плазмиду, обозначаемую RTF, а остальная часть - другую реплицирующуюся, но неконъюгативную плазмиду, обозначаемую г. Поскольку как RTF, так и г - независимые репликоны, каждая из них должна содержать модуль ДНК, обеспечивающий репликацию. Подобные перестройки не являются лабораторным курьезом: RTF- и г-плазмиды обнаружены и в природе.

Эти и другие данные, полученные при изучении генетики бактерий, привели к идентификации дискретных подвижных элементов, названных инсерционными последовательностями и транспозонами, которые способны перемещаться не только между плазмидами, но и между плазмидными и клеточными геномами. Многие модули в плазмидах обычно являются подвижными элементами или фланкированы ими.

Плазмиды как векторы. Многие плазмиды используют в качестве векторов для молекулярного клонирования в Е. coli. Плазмиды, обнаруженные в природе, впоследствии были модифицированы, укорочены, реконструированы и подвергнуты рекомбинации. В результате были получены универсальные плазмиды, предназначенные для решения конкретных экспериментальных задач. Лучшие из них содержат генетические маркеры, позволяющие упростить отбор рекомбинантных молекул. Из всех векторов при работе с Е. coli чаще всего используют плазмиду pBR322. Этот вектор был сконструирован с помощью классических генетических методов (in vivo) в сочетании с методами, применяемыми при работе с рекомбинантными ДНК, и обладает многими свойствами идеального плазмидного Beicropa для клонирования.