Процессы культивирования микроорганизмов с учетом фаговой инфекции

Система культивирования микроорганизмов с учетом фаговой инфекции обладает характерными признаками сложной биохимической системы (БХС), которая в терминах абстрактной математической теории систем относится к классу причинно-следственных систем. Для такого рода систем характерны многоэлемент- ность; многосвязность; сложная сеть взаимодействий между элементами причинно-следственного характера; совмещенность в локальной области пространства явлений различной природы — химической, физической, биологической; иерархичность строения с большим числом уровней иерархии [60].

Стратегия анализа такого рода систем с целью построения их адекватного математического описания, в свою очередь, представляет сложную многоэтапную процедуру, которая в терминах абстрактной математической теории систем относится к классу программно-целевых систем принятия решений для достижения определенной конечной цели. Характерными признаками таких систем являются: наличие определенной цели исследования, постановка задачи по реализации этой цели и определение критерия эффективности решения задачи; разработка развернутого плана исследования с указанием основных этапов и направлений в решении задачи; пропорционально-последовательное продвижение по всему комплексу взаимосвязанных этапов и возможных направлений; организация последовательных приближений и повторных циклов исследований на отдельных этапах и т. п.

Таким образом существо системного анализа любой биохимической системы состоит в четкой характеристике объекта исследования как сложной причинно-следственной системы и четкой формулировке стратегии анализа как программно-целевой системы принятия решений при построении математической модели объекта. Стратегия такого анализа включает: 1) качественный анализ структуры БХС; 2) синтез структуры функционального оператора БХС, который осуществляется различными методами— формальными методами построения функционального оператора объекта как черного ящика, методами построения обобщенных описаний на основе глубокого знания физико-хмической и биологической сущности объекта, методом составления упрощенных описаний на основе модельных представлений; 3) идентификация и оценка переменных состояния объекта по экспериментальным данным.

Получим математическую модель процесса культивирования микроорганизмов с учетом фаговой инфекции как сложной биохимической системы (БХС) в соответствии с принципами, изложенными выше.

На первом этапе выполним качественный анализ структуры системы.

Отличительной чертой исследуемой БХС является ярко выраженное разделение системы на шесть уровней иерархии. Для каждого из уровней были построены диаграммы взаимных влияний эффектов, отражающие лишь главные факторы, влияющие на рост и развитие клетки, а также взаимодействие бактериофага с клеткой-хозяином [60].

Первый уровень иерархии эффектов характеризуется физикохимическими и биохимическими взаимодействиями между атомами, свобдными радикалами, молекулами, комплексами различного состава и строения. Второй уровень иерархии БХС характеризуется биохимическими процессами, протекающими в зараженной фагом клетке. Третий уровень характеризуется явлениями, протекающими на единичных каплях углеводородов и воздушных пузырьков. Четвертый уровень представляет совокупность эффектов на уровне агломератов клеток, пузырей, углеводородов, бактериофагов. Явления пятого уровня иерархии определяют гидродинамическую обстановку в локальном объеме технологического аппарата (ферментере). Шестой уровень иерархической структуры эффектов составляет совокупность явлений, которые определяют так называемую гидродинамическую обстановку на микроуровне в аппарате; эта совокупность явлений характеризует гидродинамическую обстановку в аппарате в целом.

Анализ диаграмм взаимных влияний эффектов на каждом из перечисленных уровней иерархии показывает, что сеть причинно- следственных связей между отдельными явлениями имеет логикоалгебраическую структуру. Это позволяет реализовать следующий этап построения математической модели системы, состоящий в получении предварительных количественных характеристик системы на основе ее чисто качественного представления в виде диаграмм взаимных влияний эффектов. Рабочим аппаратом этого этапа является алгебра логики и теории нечетких множеств, алгоритмов и высказываний, позволяющие получить количественную информацию на каждом уровне [61].

В качестве примера рассмотрен процесс культивирования микроорганизмов Вас. Thuringiensis. Для применения аппарата нечетких множеств требуется знание степеней связи различных явлений друг с другом или так называемых функций принадлежности. Для определения степеней связи между отдельными составляющими БХС Вас. Thuringiensis применен метод математического планирования эксперимента [62]. В качестве плана использован полный факторный эксперимент — 2* с наложенными на него тремя латинскими квадратами. Изучено влияние на спорообразование семи количественных факторов (содержание кислорода, температуры, пеногасителя, разведения культуры, множественности инфекции, возраста культуры) и одного качественного фактора (тип фага).'

На основе методологии нечетких множеств [61], используя предварительный качественный и экспериментальный статистический анализ построен простой эффективный алгоритм поведения биологической системы как с учетом влияния фаговой инфекции, так и без нее [63]. Однако следует отметить, что информация о поведении биологической системы носит приближенный характер и этой информации недостаточно для правильного принятия решений в реализации стратегии более глубокого анализа поведения, исследуемой биологической системы.

Поэтому построим более углубленную математическую модель динамики роста популяции с учетом возрастных особенностей клетки, гибели от продуктов метаболизма, исчерпывания компонентов питания, взаимодействия бактериафага на основе методов, изложенных в гл. 1. Для описания динамики роста популяции состояние микробиологической популяции будем характеризовать функцией распределения численности популяции по возрастному составу /(/, т), т. е. /(/, x)dx означает число клеток микробиологической популяции, возраст которых принадлежит области [х, т + ^х].

Плотность гибели клеток q(x>t) будем характеризовать такой функцией возраста и времени, что число клеток, погибших за

время tx<.tz в возрасте х,<т<т2, равно

Выведем уравнение баланса числа клеток; выделим в пространстве ферментера объем V, ограниченный поверхностью 5. Рассмотрим группу клеток возраста [х, x + dx]. Запишем в интегральной форме уравнение сохранения числа клеток, принадлежащих рассматриваемой возрастной категории:

Первое слагаемое в правой части уравнения (2.212) характеризует приток числа клеток возраста х через поверхность S в ферментере (где и, — скорость движения клеток); второе — изменение числа клеток возраста х за счет роста и гибели микробиологической популяции. Функция J отражает изменение числа клеток за счет роста и гибели клеток в группе возраста [т, т + Дт] в единице объема ферментера. Тогда за счет роста клеток популяции в группу [т, т + Дт] за единицу времени в единице объема придет число клеток, равное t), а уйдет число клеток /(т-Ь 4-Дт, t). Одновременно за единицу времени количество клеток, погибающих от воздействия фага, исчерпывание компонентов питания, метаболизма будет равно ^(т,/)Дт. Следовательно, J равняется:

Применив теорему Гаусса—Остроградского к уравнению (2.212) и перейдя к пределу при Дт-*-0, получим уравнение сохранения числа клеток, записанное в дифференциальной форме

Рассмотрим рост и гибель бактерий Вас. Thuringiensis в аппарате смешения периодического действия. Полагаем, что в аппарате происходит полное перемешивание, тогда grad f=0, grad v= =0. Будем считать клетку здоровой, если она не заражена фагом и плотность распределения таких клеток обозначим через f(т, /)> где т — возраст здоровой клетки. Через т, обозначим предельный возраст здоровой клетки, т. е. тот возраст клетки, при котором она делится на две дочерние. Число возникших здоровых клеток за время At равно f(t=0,/)Д/, а число погибающих за счет возникновения дочерних f(т/, t)At.

Тогда, учитывая деление клетки на две, запишем граничное условие для уравнения (2.213) баланса числа здоровых клеток

Клетка считается зараженной с того момента, как только в нее проникает фаг. С момента внедрения фага в клетку начинается отсчет возраста зараженной клетки — z.

Размножающийся в клетке фаг лизирует ее. Время лизиса клетки обозначим через предельный возраст зараженной клетки— zh а плотность зараженных клеток в момент t в возрасте z через fi(zj).

Уравнение динамики роста числа зараженных клеток фагом записывается аналогично уравнению (2.213)

Представим функцию скорости гибели здоровых клеток q(x>t) в виде суммы двух слагаемых

где первое слагаемое означает гибель здоровых клеток в момент- времени t в возрасте т за счет продуктов метаболизма, исчерпывания компонентов питания. Второе слагаемое означает гибель здоровых клеток в возрасте т в момент времени t за счет поражения их бактериофагом.

Зная скорость гибели числа здоровых клеток от фага, запишем граничные условия для уравнения динамики роста зараженных клеток в виде

Обозначим через N+(1) число клеток фага, имеющихся в системе в момент времени t. За время At изменение числа фаговых частиц в единице объема аппарата периодического действия будет иметь вид №Ф(/ + Д/)— N*(0-

За это время появилось число зараженных клеток, достигших предельного возраста zh равное f(zht)Az, из которых размножились бактериофаги в количестве, равном Af3(z/t t)Az, где А — урожай фага с одной зараженной клетки, достигшей предельного возраста г,. Записав баланс по числу фага и перейдя к пределу при Д/->-0, получим дифференциальные уравнения, характеризующие изменение числа бактериофагов во времени в единице объема в аппарате периодического действия

Скорость гибели здоровых клеток от фага считаем пропорциональной плотности популяции здоровых клеток и числу фаговых частиц. Механизм гибели здоровых клеток от фага строился на основе подобия механизму адсорбции фагом клетки в виде

где параметры ?ф, п определяются из эксперимента.

Для разрешения системы уравнений (2.213) — (2.218) необходимо знание механизма гибели микробиологической популяции от продуктов метаболизма и за счет исчерпывания компонентов питания.

Для каждой конкретной культуры получение механизма гибели является предметом отдельного исследования. Изучается влияние параметров окружающей среды на рост популяции. Так при изучении динамики роста бактерий Вас. Thuringiensis, как наиболее влияемые факторы на рост популяции выделены [64]; потребление аминного азота, глюкозы, кислорода, выделение углекислого газа. На этом основании механизм гибели представлен в виде

где сСо2» с, cN, сг — концентрации углекислого газа, кислорода, аминного азота, глюкозы, соответственно, в среде окружающей микробиологическую популяцию: kiy kZy kiy kiy kb — кинетические параметры, определяемые из эксперимента.

Уравнение изменения компонентов питания в среде имеет вид

где а'— потребление i-ro компонента питания отдельной клеткой.

Таким образом, полная математическая модель роста микробиологической популяции с учетом заражения и гибели клеток при взаимодействии с фагом в аппарате периодического действия имеет вид:

1) уравнение баланса числа здоровых клеток

2) уравнение баланса числа зараженных клеток

3) уравнение изменения бактериофагов

4) уравнение сохранения массы углекислого газа

5) уравнение сохранения массы кислорода

Ь) уравнение сохранения массы аминного азота

7) уравнение сохранения массы глюкозы начальные условия

где индекс 0 означает начальное состояние параметра; kc—коэффициент массоотдачи.

Построим разностную схему решения системы уравнений (2.222—2.229). Для получения решения, сходящегося к точному решению системы уравнений, необходимо предъявить следующие требования к разностной схеме: 1) схема должна с достаточной степенью точности аппроксимировать систему; 2) схема должна быть устойчивой. Для решения системы (2.222—2.229) использовалась явная схема с первым порядком аппроксимации по /, т, г, удовлетворяющая вышеуказанным требованиям [52], имеющая вид

где т = 02, C02N, г; i — точка разбиения по координате времени; / — разбиение по координате возраста здоровой клетки; k — разбиение по координате возраста зараженной клетки; Nи Ыг— конечная точка числа разбиений по возрасту т, z соответственно. Для устойчивости схемы (2.230) были взяты соотношения между шагами по возрасту и времени в виде

В качестве объекта исследования были выбраны бактерии Вас. Thuringiensis и фаги, лизирующие их — Т„4 и Те81 с урожаем А, соответственно 60 и 2000.

Для решения системы (2.222—2.229) необходимо еще знать параметры а', т/, z,.

По результатам исследований [64, 65, 66], проведенными с данными бактериями, значения упомянутых параметров равны: предельный возраст здоровой клетки т/=35 мин; предельный возраст зараженной клетки z,=40 мин; а°’ ~ а00 ~0,42- • 10_" (мл/мин); ак~0,8-10_"> (мг%/мин); аг~0,35-10-8 (мг%/ /мин); начальные значения для c0N=12 мг%; сг= 1200 мг%; с^°! = 0; с°! =8 мг/л.

На первом этапе решалась задача, связанная с ростом и гибелью бактерий Вас. Thuringiensis без взаимодействия с фагом. Был поставлен эксперимент [67], повторенный 3 раза на данной культуре. Для определения динамики роста бактерий Вас. thuringiensis без взаимодействия с фагом в кювету заливали бульон Хоттингера, затем вносили инокулят и подращивали в течение 10 ч в термостатированной комнате при (=37° С. После лаг-периода пробы отбирались через каждый час и раститровывались на бактерии. Экспериментальная кривая роста приведена на рис. 2.29. Так как фаг не добавлялся, то единственной причиной гибели бактерий могут стать продукты метаболизма и исчерпывание компонентов питания — с0,, cN, сг. Механизм гибели искали по формуле (2.220). Решалась система уравнений (2.222) — (2.229) (без балансовых уравнений числа зараженных клеток и фага), строился функционал Ф,= (М«ор—Максвер)2, где N=

Ч

= J f(xt)dx— число всех здоровых клеток в выбранной едини-

О

це объема (1 мл). Индексы «теор», «экспер» означают результаты теоретического расчета и эксперимента. Для определения кинетических параметров *,, *2, *,, *,, *5 искался минимум функционала Ф, по этим параметрам. Значения параметров А, = 0,01; fe2 = 0,11; *з = 0,11; *,= 12; *5 = 1,6 обеспечили минимум функционалу Ф,. Из рис. 2.29 видно, что результаты расчета и экспериментальные данные хорошо согласуются друг с другом. Нас интересовал также вопрос, как будет расти популяция, если предположить, что бактерии не гибнут. Задав q, = 0, построим теоретическую кривую роста популяции (см. рис. 2.29—пунктир), заметно отличающуюся от реальной кривой роста бактерий. Следовательно, если в процессе роста в популяции убирать вредные для нее продукты и добавлять по программе компоненты питания ск, сг, с0„ то рост популяции заметно усилится. К моменту времени равным 7 час (от начала роста популяции) значения

Рис. 2.29. Динамика роста бактерий Вас. thuringiensis

  • 1 — без учета гибели клеток;
  • 2 — с учетом гибели клеток; точки — экспериментальные значения

числа клеток в единице объема без гибели составляют 1,36-10**, а с гибелью 3-10*).

На втором этапе решалась задача, связанная с ростом и гибелью бактерий Вас. Thuringiensis с учетом взаимодействия с фагами— Tg4, Tg81. Для каждого типа фага ставился ряд экспериментов, каждый из которых повторялся дважды, по следующей схеме:

Для фага Tg4. Фаг добавлялся в течение 4, 5, 6 ч с момента

роста популяции с множественностью инфекции, равной МИ=20 (20 фаговых частиц на одну клетку), затем через каждый час проводился отбор пробы, титрование и измерение оптической плотности.

Для фага Tg81. Фаг добавлялся через 2, 3 ..., 6 ч с момента роста культуры, ввиду того, что бактерии чувствительны к фагу Tg81 на первых часах экспериментального роста. Множественность инфекции МИ-20. Пробы через каждый час отбирались и раститровывались.

Для каждого эксперимента решалась полная система уравнений (2.222) — (2.229), строился функционал

N»кспер)2 и методом сканирования (для обеспечения минимума функционала — Ф2) находились значения параметров Кф, п.

В результате расчета получили:

Для фага Tg4. Константа адсорбции — ?Ф = 0,13*1(Н; порядок «реакции» и = 0,25.

Для фага Tg81. Константа адсорбции — ?ф = 0,44-10~4 для Nq/Nc40, 6ф = 0 для NJN^40 (где N0 число клеток в момент внедрения фага в культуру, число 40 — результат эксперимента); порядок «реакции» /г = 0,25. Нулевое значение константы адсорбции объясняется тем, что при гибели популяции от фага, при достижении численности клеток порядка ЛГо/40, происходят биохимические изменения внутри клетки Вас. thuringiensis, приводящие к потери адсорбции фага.

В табл. 2.3 представлены теоретические и экспериментальные значения числа клеток популяции при взаимодействии с фагом Tg4 в контрольных точках (в точках которых происходит отбор пробы), удовлетворительно согласующиеся друг с другом.

Таблица 2.3. Динамика роста оактерий Вас. thuringiensis при взаимодействии с фагом Tg 4

Время введения фага, ч

Отбор пробы

Время отбора, ч

Титр бактерий

Эксперимент

Теория

4

7

2,7*10®

3*10®

5

8

8*10®

7,9*10®

6

9

МО®

1,11*10®

На рис. 2.30 представлены кривые роста данной популяции при введении фага Tg4 через 5 и 6 часов с момента внесения популяции в аппарат. Видно, что при введении фага в соотношении 1000 фаговых частиц на одну клетку через 3 ч после внесения фага популяция полностью гибнет.

На рис. 2.31 представлены теоретические кривые роста бактерий Вас. Thuringiensis при инфекции фагом Tg4, позволяющие сделать вывод, что чем позже внедряется фаг в клетку, тем меньше влияния он оказывает на рост популяции.

На рис. 2.32 представлены теоретические кривые роста и экспериментальные значения числа клеток популяции при взаимодействии с фагом Tg81. Из рис. 2.32 следует, что при внесении фага Tg81 уже в количестве 20 единиц на одну клетку рост популяции резко уменьшается, а при достижении числа клеток равно NJN = 40 за счет того, что клетка прекращает адсорбировать фаг, вновь начинается рост популяции.

В результате решения системы уравнений математической модели рассчитаны теоретические кривые роста спорообразующих бактерий Вас. Thuringiensis в условиях действия двух типов фагов Tg4 и Tg81, введенные в разные часы экспоненциального роста культуры.

Из анализа результатов моделирования следует, что при взаимодействии спорообразующих бактерий Вас. Thuringiensis с фагом Tg81 резкое изменение кривой роста наступает уже при множественности инфекции, равной 20, за счет того, что урожай фага Tg81 значительно превышает урожай фага Tg4. Поэтому внесение фага Tg81 с множественностью инфекции 20 отражается на популяции в первый час внедрения фага, а далее количество бактериофагов, образовавшихся из клеток популяции Вас. Thuringiensis, зависит от его урожайности. При достижении числа клеток, равного No/N = 40, для фага Tg 81 за счет потери фагоадсорбирующей способности начинается вторичный рост культуры. Установлено также, что при инфекции бактерий фагом Tg81 в течение 2,...» 5 ч культура лизируется, а к 6 ч роста приобретает фагоустойчивость

В результате проведенного моделирования получены также кривые роста спорообразующих бактерий Вас. Thuringiensis при инфекции фагом Tg4 в 4, ..., 6 ч роста культуры с множест-

Рост бактерий Вас. thuringiensis при инфекции фагом Tg4 различной множественности инфекции в возрасте культуры 5 ч

Рис. 2.30. Рост бактерий Вас. thuringiensis при инфекции фагом Tg4 различной множественности инфекции в возрасте культуры 5 ч

Рис. 2.31. Рост бактерий Вас. thuringiensis при инфекции фагом Tg4 /—3—4, 5 и 6 ч соответственно

Рис. 2.32. Рост бактерий Вас. thuringiensis при инфекции фагом Tg81 с М. И., равной 20, в разном возрасте культуры (точки — экспериментальные значения)

венностью инфекции от 20 до 2000. Из рис. 2.31 следует, что чем позже внедряется фаг в клетку, тем меньше влияния он оказывает на рост популяции.

Из рис. 2.30 следует, что при заражении спорообразующих бактерий Вас. Thuringiensis фагом Tg4 с множественностью инфекции, равной 1000, популяция полностью гибнет.

В результате исследования процесса культивирования бактерий Вас. Thuringiensis в условиях действия фаговой инфекции методами математического моделирования подтверждено, что культура Вас. Thuringiensis к разным фагам имеет различную чувствительность.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >