Получение клеточных культур высших растений и их свойства

Важные для практики технологии in vitro разработаны с использованием объектов разной сложности организации, начиная с изолированных протопластов и кончая изолированными органами или зародышами. Однако во всех случаях центральная роль принадлежит культивируемым клеткам. Основным представителем культивируемых в условиях in vitro растительных клеток является каллус.

Каллусной тканью, или каллусом называют ткань, возникшую путем неорганизованной пролиферации клеток растений. В свою очередь, пролиферация это новообразование клеток и тканей путем размножения.

Для получения каллуса фрагменты тканей разных органов растений, называемые эксплантами, помещают на искусственную питательную среду в пробирки, колбы или чашки Петри. Процесс получения и культивирования каллуса требует абсолютной асептики. Экспланты обрабатывают различными стерилизующими растворами, содержащими чаще всего активный хлор или ртуть (гипохлориты, сулема, диацид), к которым для лучшего смачивания добавлены детергенты. Питательные среды и посуду перед использованием стерилизуют горячим паром в автоклавах. Соединения, разрушающиеся при высокой температуре, стерилизуют путем фильтрации через специальные фильтры, размер пор которых не превышает 0,2 мкм.

В состав питательных сред входят основные элементы, необходимые для поддержания жизни растений: калий, кальций, азот, магний, фосфор, сера, а также микроэлементы: железо, цинк, бор, медь, марганец, кобальт и другие (в виде солей). Поскольку культивируемые клетки не способны к фотосинтезу, то в питательные среды добавляют углеводы, чаще всего сахарозу или глюкозу, являющиеся источниками энергии. Каллусные клетки нуждаются также в витаминах.

Таблица 1.1

Состав стандартных питательных сред для культивирования клеток растений

Компоненты сред

Концентрация в среде (мг/л)

Мура- сиге и Скуга

Гамборга и Эвелега (В5)

Уайта

Нича и Нич

N6

KN03

1900

2500

80

950

2830

nh4no3

1650

720

Ca(N03)2 х 4 Н20

208

(NH4)2S04

134

463

MgS04 х 7Н20

370

250

750

185

185

СаС12 х 2Н20

440

150

189

165

Окончание табл. 1.1

Компоненты сред

Концентрация в среде (мг/л)

Мурасиге и Скуга

Гамборга и Эвелега (В5)

Уайта

Нича и Нич

N6

КС1

65

КН2Р04

170

12

68

400

NaH2P04

130

16,5

Na2S04

200

MnS04 х 4Н20

22,3

13,2

5

25

4,4

ZnS04 х 7Н20

8,6

2

3

10

1,5

н3во4

6,2

3

1,5

10

1,6

CuS04 х 5Н20

0,025

0,025

0,01

0,025

Na2Mo04 х 2Н20

0,25

0,25

0,001

0,25

СоС12 х 6Н20

0,025

0,025

KJ

0,83

0,75

0,75

0,8

FeS04 х 7Н20

27,85

27,85

4,6

27,85

27,85

Na2EDTA х 2Н20

37,3

37,3

37,3

37,3

Мезоинозит

100

100

100

100

Тиамин хлорид

0,1

10

1

1

Пиридоксин-хлорид

0,5

1

0,5

0,5

Никотиновая кислота

0,5

1

0,5

0,5

Сахароза

30000

20000

20000

30000

30000

Агар-агар

7000

7000

7000

7000

7000

Потребность клеток в азоте удовлетворяется за счет введения в состав среды гидролизата казеина или отдельных аминокислот. Очень важным компонентом питательных сред являются природные фитогормоны (ИУК, ИМК, зеатин) или синтетические регуляторы роста с гормональной активностью: ауксиновой-нафтилуксусная кислота (НУК),

2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) или цитокининовой-бензи- ламинопурин (БАП), кинетин и др.

Разработано несколько вариантов стандартных питательных сред (табл. 1.1). Среда Мурасиге — Скуга является наиболее универсальной. Она используется для культивирования клеток многих видов растений. Среда Гамборга-Эвелега (Б5) дает хорошие результаты при культивировании тканей бобовых, а среда N6 — злаковых растений. Среда Уайта применяется для укоренения и выращивания побегов после регенерации растений. Среда Нина и Нич рекомендуется для индукции андрогенеза в культуре пыльников. Иногда в состав питательных сред включают различные растительные экстракты, например, картофельный экстракт или кокосовое молоко. Для придания средам плотности добавляют агар-агар или агарозу.

Клетки растений чувствительны к условиям культивирования. Оптимальным для их роста режимом является температура 26±1°С и влажность 70%.

Известно, что клетки интактного растения дифференцированы. Они предназначены для выполнения определенной функции. Большинство специализированных клеток утрачивает способность к делению. Для превращения в каллусные клетки ткани растения должны пройти дедифференциацию, т.е. потерять характерные для них структуры и свойства и вернуться к состоянию делящейся клетки. Этот процесс происходит под действием фитогормонов или регуляторов роста, содержащихся в питательной среде. При образовании каллусных тканей большая часть генов, экспрессирующихся в дифференцированных клетках экспланта, перестает работать, и активируются другие гены, ответственные за деление, растяжение и синтез первичных метаболитов, так как быстрое размножение это основная функция каллусных клеток. Соответственно меняется и набор синтезируемых белков, ферментов, в результате чего метаболизм клеток существенно перестраивается. В первую очередь они теряют запасные вещества — липиды, крахмал. Фотосинтезирующие клетки теряют хлорофилл и липиды хло- ропластов, но при этом возрастает количество амилопластов, перестраиваются эндоплазматический ретикулюм, аппарат Гольджи и элементы цитоскелета. Все эти изменения предшествуют началу делений, которое в присутствии ауксина и цитокинина начинается через 48—72 часа после индукции каллусогенеза.

Ткань, образующаяся на питательной среде из клеток экспланта, называется первичным каллусом. Для поддержания его роста по мере истощения элементов питания часть каллуса периодически переносят на свежую питательную среду. Время между пересадками (субкультивированиями) варьирует в зависимости от скорости роста тканей от 3 до 6 недель. Каллус, постоянно поддерживаемый в культуре in vitro, называется пассируемым. Культивирование каллуса на твердой питательной среде называется поверхностным.

Суспензионные клеточные культуры это клетки растений, выращиваемые в жидкой питательной среде. Этот способ культивирования называется глубинным. Состав жидкой среды, как правило, такой же, как и твердой, но в этом случае агар в нее не добавляется. Для получения суспензионной культуры лучше использовать рыхлые каллусы, распадающиеся в жидкой среде на отдельные клетки и/или агрегаты, состоящие из 5—50 клеток. Суспензионные культуры выращивают в колбах при обязательном перемешивании на качалках, чтобы обеспечить нормальное снабжение клеток кислородом. Периодически часть суспензии (инокулюм) переносят в свежую питательную среду для поддержания непрерывного роста. Клетки в жидкой питательной среде размножаются обычно быстрее, чем на твердой, поэтому промежуток времени между пересадками сокращается до 2—3 недель.

При работе с суспензионными культурами можно применять методы, разработанные для культивирования микроорганизмов: получение клонов из одиночных клеток, использование селективных сред, выращивание больших масс клеток в специальных аппаратах — биореакторах. Поэтому клеточные суспензии широко используются при изучении различных физиологических процессов, при отборе мутантов, а также для производства биологически активных веществ.

Характер роста культивируемых клеток и их состояние оценивают по доле живых клеток, скорости роста и активности клеточных делений. Жизнеспособность клеток определяют под микроскопом с использованием специальных красителей, например, метиленовой синей, феносафранина, эозина и др. Краситель не проникает в живые клетки, сохранившие целостность плазматической мембраны, поэтому окрашиваются только мертвые клетки.

Рост культур оценивают по увеличению сырой или сухой массы ткани в цикле выращивания или по увеличению числа клеток в 1 мл. Последний показатель чаще используют для суспензионных культур. Рост тканей складывается из деления и растяжения клеток. В культуре in vitro он описывается S-образной кривой (рис. 1.1).

Модельная кривая роста культивируемой ткани

Рис. 1.1. Модельная кривая роста культивируемой ткани.

Фазы роста: 1 —латентная; 2 — логарифмическая; 3 —линейная;

4 — замедления роста; 5 — стационарная; 6 —деградации

Весь цикл роста принято делить на несколько фаз: латентная (лаг- фаза), где видимый рост не наблюдается; экспоненциальная, где рост идет с ускорением; линейная, где скорость роста постоянна; фаза замедления роста, стационарная фаза, во время которой масса ткани и число клеток не меняются и фаза деградации, сопровождающаяся гибелью клеток. В зависимости от вида растения, используемого экс- планта, состава питательной среды или условий выращивания продолжительность отдельных фаз ростового цикла может изменяться.

Для характеристики активности деления используют показатель называемый митотическим индексом. Это доля клеток, находящихся в данный момент времени в фазе митоза. Определяют митотический индекс под микроскопом на давленых препаратах или срезах тканей, окрашенных ацетоорсеином или ацетокармином, как процент делящихся клеток от их общего числа.

Митотическая активность клеток максимальна в экспоненциальной фазе роста, затем она понижается (рис. 1.2). В зависимости от вида растения кривая митотического индекса может иметь один или два максимума. Первая волна делений клеток вызвана их переносом на свежую питательную среду. Вторая связана с повторным вступлением клеток в митоз или с наличием двух субпопуляций клеток, имеющих разную продолжительность клеточного цикла. Культивируемые клетки размножаются несинхронно, поэтому в каждый конкретный момент времени доля делящихся клеток не превышает 5%. Ближе к концу клеточного цикла деления почти прекращаются и увеличение массы ткани идет, главным образом, за счет растяжения клеток и накопления продуктов биосинтеза.

Модельная кривая митотической активности клеток в цикле выращивания

Рис. 1.2. Модельная кривая митотической активности клеток в цикле выращивания

Лаг-фазу определяют как процесс адаптации клеточной популяции к новым условиям роста. Ее длительность зависит от количества и физиологического состояния инокулята, а также состава питательной среды, газового режима и условий перемешивания. В этот период различные штаммы культур клеток способны активно изменять начальный pH питательной среды в диапазоне от 3,5—6,5 до некоторого оптимального для каждой культуры клеток значения. В лаг-фазе наблюдается высокая интенсивность дыхания, энергетический уровень клетки достигает максимума, интенсивно синтезируется ДНК, РНК, белки и другие компоненты клетки. Митотический индекс в это время еще низок.

В экспоненциальной (логарифмической) фазе митотическая активность клеточной популяции достигает максимальных величин. В этот период преобладают мелкие клетки меристематического типа; pH культуральной жидкости в период экспоненциального роста, как правило, ниже, чем в другие ростовые фазы.

Снижение частоты митозов свидетельствует о переходе клеточной популяции в фазу линейного, а затем замедленного роста. Это связано с недостатком питательных веществ и (или) ингибированием продуктами обмена. Начинается процесс растяжения и вакуолизации клеток. При замедлении роста уровень дыхания снижается. Часть клеток переходит в дифференцированное состояние. В этой фазе наблюдается увеличение синтеза вторичных веществ.

В следующей затем стационарной фазе скорость деградации клеток еще мала и может быть уравновешена делениями клеток. Поэтому масса и число клеток почти не изменяются. Продлению стационарной фазы может способствовать отсутствие лимитации по углеводному питанию, температурный оптимум, соответствующий газовый режим и др.

В фазе отмирания или деградации культуры число гибнущих клеток превышает количество вновь возникающих, поэтому общая масса ткани уменьшается.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >