Клеточная селекция

Клеточной селекцией называется отбор в культуре in vitro клеток с заданными свойствами. Преимуществом отбора in vitro по сравнению с традиционной селекцией является возможность манипулировать миллионами генотипов в малом объеме. Если высадить в поле растения, по количеству соответствующие числу клеток в одной колбе (а это примерно 100 миллионов), они займут десятки гектаров. Затраты на обработку такого поля и проведение селекционных мероприятий будут гораздо больше, чем в случае применения клеточной селекции. Кроме того, работы в лабораторных условиях не зависят от сезона и погоды. При использовании клеточной селекции время, необходимое для создания нового сорта, сокращается на 2—4 года.

Все операции, связанные с проведением клеточной селекции, можно разделить на несколько этапов (рис. 1.22).

1. Получение каллусной или суспензионной культуры.

Если предполагается, что в результате клеточной селекции будут получены растения с новыми свойствами, необходимо получить культуру клеток, способных к морфогенезу. Следует использовать типы экс- плантов и условия культивирования, способствующие образованию морфогенных тканей.

Рис. 1.22. Схема клеточной селекции

2. Субкультивирование в течение 2—3 месяцев для увеличения количества клеток и повышения генетического разнообразия.

В процессе субкультивирования отбираются клетки, способные к регенерации растений. Иногда для повышения частоты мутаций клетки обрабатывают химическими или физическими мутагенами.

3. Выбор вида и концентрации селективного фактора.

Вид селективного фактора зависит от поставленной цели. Чтобы выбрать концентрацию селективного фактора или определить степень жесткости селективных условий, определяют реакцию растений и культивируемых клеток на стрессор в определенном диапазоне его концентраций. В качестве селективного выбирают такое воздействие, при котором выживает и сохраняет способность к морфогенезу 20—30% клеток.

4. Инкубация культивируемых тканей в селективных условиях, отбор выживших клонов.

Селективные агенты добавляют в среду культивирования клеток. Выжившие клетки вновь пересаживают на селективную питательную среду. Такой отбор повторяют несколько раз.

• 5. Стабильно устойчивые клоны переносят на среду для регенерации растений.
• 6. Проверка устойчивости растений-регенерантов.

Растения, полученные из устойчивых клонов, помещают в селективные условия. При этом выбирается такая концентрация стрессора, которая в значительной степени или полностью ингибирует рост исходных растений.

• 7. Размножение выживших растений.
• 8. Проверка устойчивости потомства растений-регенерантов.

Седьмой и восьмой этапы проводятся уже не в лабораторных,

а в полевых условиях. На этом заканчивается работа биотехнолога. Образцы, которые продемонстрировали стабильное и наследуемое проявление улучшенных признаков, передают селекционерам и включают в селекционный процесс. Таким образом, методы биотехнологии не заменяют традиционную селекцию, а служат для повышения ее эффективности и ускорения селекционного процесса.

Получение растений, толерантных к неблагоприятным природным условиям. На уровне отдельных клеток трудно вести отбор по таким многокомпонентным признакам как урожайность, продолжительность вегетационного периода, фотопериодичность и др., определяемым в большей степени на уровне целого организма. Вместе с тем культивируемые ткани успешно используются для улучшения качества и количества растительного белка, увеличения продукции ряда соединений вторичного метаболизма. Для отбора растений с увеличенным содержанием незаменимых аминокислот используют селекцию на средах, содержащих их токсичные аналоги. Повышенное содержание триптофана было отмечено в растениях, регенерированных из клонов, резистентных к 5-метилтриптофану. На средах с ингибирующими концентрациями лизина и треонина были выделены линии и регенерированы растения с измененной активностью фермента аспартаткиназы. В результате мутации уменьшилась чувствительность аспартаткиназы к ингибированию лизином. Полученные растения характеризовались повышенным в несколько раз содержанием аминокислот, синтез которых идет по аспартатному пути: лизина, треонина, изолейцина и метионина.

Однако чаще всего клеточная селекция применяется для отбора форм, толерантных к различным биотическим и абиотическим стрессам.

Очень важным является вопрос о соответствии реакции на стрессы целых растений и изолированных клеток, который исследован пока еще недостаточно полно, и имеющиеся данные довольно противоречивы. Так, показана положительная корреляция между реакциями каллусных тканей и растений при исследовании влияния повышенной кислотности почвы и токсичного уровня алюминия, а также действия высоких и низких температур. А вот чувствительность к засолению in vivo и in vitro совпадает не всегда. Описаны случаи, когда каллусные ткани, полученные от солетолерантных сортов, были более устойчивы к NaCl, чем ткани, выделенные из солечувствительных форм. Но есть и обратные примеры: утрата свойства солеустойчивости в культуре in vitro описана для типичного галофита солероса. Противоречивость опубликованных данных, вероятно, связана с многообразием защитных реакций, среди которых часть координируется на организменном уровне (например, наличие специальных желез для выведения соли из организма растения, отложение солей в покровных тканях и др.), а часть регулируется на клеточном уровне. С учетом приведенных данных следует с большой осторожностью использовать изолированные клетки для тестирования устойчивости тех или иных сортов культурных растений. Вместе с тем, накоплено уже много данных о большой роли молекулярных механизмов в обеспечении устойчивости растений к биотическим и абиотическим стрессам. Поэтому высока вероятность повышения толерантности у растений, регенерированных из отобранных in vitro резистентных клеточных линий.

Для селекции толерантных к неблагоприятным условиям окружающей среды клеток чаще всего используют непосредственно стрессовый фактор: NaCl или Na₂S0₄ для отбора солеустойчивых вариантов, гербициды, соли тяжелых металлов и т.п. (табл. 1.6). Путем клеточной селекции на средах с хлоридом натрия получены солеустойчивые растения табака, люцерны, пшеницы и других видов. В селективных системах с Na₂S0₄ отобраны растения ячменя, табака и др., толерантные к сульфатному засолению. Ряд холодоустойчивых форм получен из клеток, выделенных in vitro по способности переживать инкубацию при низких положительных температурах.

Таблица 1.6

Примеры отбора толерантных к неблагоприятным природным условиям растений с использованием различных стрессовых факторов

Путем отбора клеток, устойчивых к низким значениям pH и солям алюминия, получены растения ячменя, риса и сорго, толерантные к этому металлу и успешно растущие на кислых почвах. С помощью метода клеточной селекции были получены растения кукурузы, устойчивые к гербицидам амидазолинону и сетоксидиму. В результате отбора клеток на средах с постепенно повышающимися концентрациями гербицидов были выделены клеточные линии, растения из которых выдерживали дозы гербицидов в 3—10 раз более высокие, чем исходные формы.

Иногда применяют специальные селективные системы, выбор которых основан на использовании специфических механизмов устойчивости (табл. 1.7).

Таблица 1.7

Примеры отбора устойчивых растений с помощью специальных селективных систем

Окончание табл. 1.7

Например, установлена положительная корреляция между накоплением в клетках пролина и повышением устойчивости растений к обезвоживанию, вызванному засолением, засухой или низкими температурами. Активность ферментов, катализирующих биосинтез пролина, ингибируется избытком продукта, что не дает возможности существенно повысить в тканях уровень этой аминокислоты. Для повышения эндогенного уровня пролина проводят селекцию на средах, содержащих его токсичные аналоги. В этих условиях выживают только те клетки, у которых ферменты биосинтеза пролина нечувствительны к ингибированию по типу обратной связи, и концентрация пролина увеличена. Путем отбора клеток в присутствии Ь-азетидин-2-карбоновой кислоты получены толерантные клеточные линии сои, табака и риса. На средах с другим аналогом пролина — тиазолидинкарбоновой кислотой удалось выделить устойчивые клетки люцерны и манго. Толерантные к оксипролину клеточные культуры и растения получены у риса, ячменя и пшеницы. Устойчивые к аналогам аминокислоты варианты характеризовались повышенным содержанием пролина и, как правило, были более устойчивы к NaCl, чем исходные формы. Растения пшеницы и ячменя, полученные путем клеточной селекции на среде с оксипро- лином, обладали повышенной морозоустойчивостью. Для отбора толерантных к холоду растений селекция на средах с пролином оказалась более эффективной, чем прямой отбор при пониженной температуре.

Засоление и низкая температура вызывают обезвоживание растительных тканей, поэтому увеличение способности клеток удерживать воду способствует повышению устойчивости к этим стрессовым факторам. Для отбора клонов, толерантных к обезвоживанию, используют среды с осмотиками: полиэтиленгликолем, маннитом, сорбитом. В селективной системе с ПЭГ были получены солеустойчивые клеточные линии и растения риса, а с использованием маннита — солеустойчивые растения табака и пшеницы.

Избыток соли нарушает метаболизм серы в растениях, вызывает уменьшение пула серосодержащих аминокислот цистеина и метионина. Нехватка этих аминокислот создает неблагоприятные условия для протекания сопряженных с метаболизмом серы путей биосинтеза азотистых соединений, углеводов и липидов. Суперпродукция метионина способна восполнить дефицит серы, возникающий в условиях засоления. Для отбора клеток с повышенной активностью биосинтеза метионина рекомендованы среды с его токсическим аналогом этионином.

Еще одним селективным фактором, имитирующим сульфатно-хлорид- ное засоление, является морская вода, добавленная к питательной среде в ингибирующих рост клеток дозах. Полученные из выживших на селективных средах каллусов растения табака и пшеницы были толерантны к токсичным для растений дикого типа концентрациям солей и характеризовались в стрессовых условиях повышенным содержанием пролина.

Каждая из перечисленных систем отбора солеустойчивых клеток имеет свои преимущества. В случае использования специальных селективных систем направленно отбираются варианты, солеустой- чивость которых обусловлена определенным механизмом. При проведении селекции на средах с хлоридом или сульфатом натрия разнообразие механизмов устойчивости у отселектированных форм будет значительно больше, хотя без специального исследования нельзя будет сказать, какова конкретная причина толерантности. Использование в качестве селективного фактора морской воды имеет практическую направленность на получение растений, для полива которых можно применять соленую воду.

Получение растений, устойчивых к болезням. Большим разнообразием характеризуются селективные системы, используемые для получения растений, устойчивых к патогенам. В тех случаях, когда поражающим фактором являются токсичные продукты жизнедеятельности патогенных грибов или бактерий, для отбора устойчивых клеток в питательную среду добавляют фильтрат культуральной жидкости возбудителя или очищенный токсин. Путем селекции на средах с культуральным фильтратом Fusarium или фузариевой кислотой получены растения люцерны, томатов, картофеля и пшеницы с повышенной устойчивостью к фузариозу. Отбор на средах с продуктами жизнедеятельности разных видов Helminthosporium позволил выделить формы пшеницы, кукурузы, ячменя и риса, невосприимчивые к гельминтоспорозу. Аналогичным образом получены растения табака, устойчивые к Pseudomonas syringae, растения картофеля, устойчивые к кольцевой гнили и другие невосприимчивые формы разных видов культурных растений.

Однако выделяемые патогенами токсины не всегда являются единственным или главным поражающим фактором. Поэтому устойчивость к токсинам может не коррелировать с устойчивостью к возбудителям болезней. В этом случае для отбора толерантных растений рекомендованы другие системы клеточной селекции. Одним из способов является инокуляция клеток каллусных культур спорами возбудителя болезни. После развития инфекции отбирают непораженные сектора и регенерируют из этих клеток растения. Таким способом были выделены растения риса, устойчивые к пирикуляриозу.

В связи с высокой скоростью мутирования патогенов, приводящей к возникновению новых рас, специфическая устойчивость растений по принципу «ген на ген» не может надолго их защитить. Поэтому большой интерес представляют различные виды неспецифической устойчивости, обусловленные характером взаимодействия паразита и хозяина. Например, для активного роста и спороношения грибы родов Phytophthora и Pythium нуждаются в определенных растительных стеринах. На растениях с нестандартным составом стеринов данные грибы не способны паразитировать. Для отбора таких растений культивируемые ткани картофеля подвергали действию полиеновых антибиотиков, в присутствии которых выживали только клетки с измененным соотношением стероидных соединений. Из резистентных к антибиотикам клеток были регенерированы растения, среди которых удалось отобрать образцы, устойчивые к фитофторе. Данная селективная система оказалась полезной и для создания растений, устойчивых к насекомым- вредителям, которые также нуждаются в стероидных соединениях растительного происхождения для осуществления линьки, метаморфоза личинок и формирования репродуктивной системы.

Другой подход к повышению устойчивости растений связан с ограничением проникновения в них патогенов. Одним из первых этапов заражения является разрушение клеточных стенок растений гидролитическими ферментами, продуцируемыми возбудителем. Было высказано предположение, что снижение чувствительности к пектиназе и целлюлазе повысит устойчивость к патогенам. По крайней мере, по отношению к пектиназе это предположение оказалось верным. Среди растений картофеля, регенерированных из каллусов на среде с пектиназой в сублетальной концентрации, были формы с повышенной устойчивостью к фитофторозу, черной ножке и кольцевой гнили. При этом до 15% регенерантов характеризовались невосприимчивостью одновременно к нескольким патогенам.

Одним из механизмов защиты от патогенных грибов является выделение растением различных ингибиторов. Большинство ингибиторов является фенольными соединениями или их окисленными формами. Накопление фенольных соединений и активация окисляющих их ферментов коррелирует с устойчивостью к патогену. Предшественниками в биосинтезе фенольных соединений являются фенилаланин и триптофан, поэтому обогащение клеток этими аминокислотами может привести к повышенной продукции фенольных соединений. Использование токсических аналогов аминокислот 5-метил-триптофана и парафторфе- нилаланина действительно позволило выделить клоны с суперпродукцией основной аминокислоты. У выделенных клонов активность защитных реакций была намного больше уровня в контрольных клонах.