Клеточная селекция

Клеточной селекцией называется отбор в культуре in vitro клеток с заданными свойствами. Преимуществом отбора in vitro по сравнению с традиционной селекцией является возможность манипулировать миллионами генотипов в малом объеме. Если высадить в поле растения, по количеству соответствующие числу клеток в одной колбе (а это примерно 100 миллионов), они займут десятки гектаров. Затраты на обработку такого поля и проведение селекционных мероприятий будут гораздо больше, чем в случае применения клеточной селекции. Кроме того, работы в лабораторных условиях не зависят от сезона и погоды. При использовании клеточной селекции время, необходимое для создания нового сорта, сокращается на 2—4 года.

Все операции, связанные с проведением клеточной селекции, можно разделить на несколько этапов (рис. 1.22).

1. Получение каллусной или суспензионной культуры.

Если предполагается, что в результате клеточной селекции будут получены растения с новыми свойствами, необходимо получить культуру клеток, способных к морфогенезу. Следует использовать типы экс- плантов и условия культивирования, способствующие образованию морфогенных тканей.

Схема клеточной селекции

Рис. 1.22. Схема клеточной селекции

2. Субкультивирование в течение 2—3 месяцев для увеличения количества клеток и повышения генетического разнообразия.

В процессе субкультивирования отбираются клетки, способные к регенерации растений. Иногда для повышения частоты мутаций клетки обрабатывают химическими или физическими мутагенами.

3. Выбор вида и концентрации селективного фактора.

Вид селективного фактора зависит от поставленной цели. Чтобы выбрать концентрацию селективного фактора или определить степень жесткости селективных условий, определяют реакцию растений и культивируемых клеток на стрессор в определенном диапазоне его концентраций. В качестве селективного выбирают такое воздействие, при котором выживает и сохраняет способность к морфогенезу 20—30% клеток.

4. Инкубация культивируемых тканей в селективных условиях, отбор выживших клонов.

Селективные агенты добавляют в среду культивирования клеток. Выжившие клетки вновь пересаживают на селективную питательную среду. Такой отбор повторяют несколько раз.

  • 5. Стабильно устойчивые клоны переносят на среду для регенерации растений.
  • 6. Проверка устойчивости растений-регенерантов.

Растения, полученные из устойчивых клонов, помещают в селективные условия. При этом выбирается такая концентрация стрессора, которая в значительной степени или полностью ингибирует рост исходных растений.

  • 7. Размножение выживших растений.
  • 8. Проверка устойчивости потомства растений-регенерантов.

Седьмой и восьмой этапы проводятся уже не в лабораторных,

а в полевых условиях. На этом заканчивается работа биотехнолога. Образцы, которые продемонстрировали стабильное и наследуемое проявление улучшенных признаков, передают селекционерам и включают в селекционный процесс. Таким образом, методы биотехнологии не заменяют традиционную селекцию, а служат для повышения ее эффективности и ускорения селекционного процесса.

Получение растений, толерантных к неблагоприятным природным условиям. На уровне отдельных клеток трудно вести отбор по таким многокомпонентным признакам как урожайность, продолжительность вегетационного периода, фотопериодичность и др., определяемым в большей степени на уровне целого организма. Вместе с тем культивируемые ткани успешно используются для улучшения качества и количества растительного белка, увеличения продукции ряда соединений вторичного метаболизма. Для отбора растений с увеличенным содержанием незаменимых аминокислот используют селекцию на средах, содержащих их токсичные аналоги. Повышенное содержание триптофана было отмечено в растениях, регенерированных из клонов, резистентных к 5-метилтриптофану. На средах с ингибирующими концентрациями лизина и треонина были выделены линии и регенерированы растения с измененной активностью фермента аспартаткиназы. В результате мутации уменьшилась чувствительность аспартаткиназы к ингибированию лизином. Полученные растения характеризовались повышенным в несколько раз содержанием аминокислот, синтез которых идет по аспартатному пути: лизина, треонина, изолейцина и метионина.

Однако чаще всего клеточная селекция применяется для отбора форм, толерантных к различным биотическим и абиотическим стрессам.

Очень важным является вопрос о соответствии реакции на стрессы целых растений и изолированных клеток, который исследован пока еще недостаточно полно, и имеющиеся данные довольно противоречивы. Так, показана положительная корреляция между реакциями каллусных тканей и растений при исследовании влияния повышенной кислотности почвы и токсичного уровня алюминия, а также действия высоких и низких температур. А вот чувствительность к засолению in vivo и in vitro совпадает не всегда. Описаны случаи, когда каллусные ткани, полученные от солетолерантных сортов, были более устойчивы к NaCl, чем ткани, выделенные из солечувствительных форм. Но есть и обратные примеры: утрата свойства солеустойчивости в культуре in vitro описана для типичного галофита солероса. Противоречивость опубликованных данных, вероятно, связана с многообразием защитных реакций, среди которых часть координируется на организменном уровне (например, наличие специальных желез для выведения соли из организма растения, отложение солей в покровных тканях и др.), а часть регулируется на клеточном уровне. С учетом приведенных данных следует с большой осторожностью использовать изолированные клетки для тестирования устойчивости тех или иных сортов культурных растений. Вместе с тем, накоплено уже много данных о большой роли молекулярных механизмов в обеспечении устойчивости растений к биотическим и абиотическим стрессам. Поэтому высока вероятность повышения толерантности у растений, регенерированных из отобранных in vitro резистентных клеточных линий.

Для селекции толерантных к неблагоприятным условиям окружающей среды клеток чаще всего используют непосредственно стрессовый фактор: NaCl или Na2S04 для отбора солеустойчивых вариантов, гербициды, соли тяжелых металлов и т.п. (табл. 1.6). Путем клеточной селекции на средах с хлоридом натрия получены солеустойчивые растения табака, люцерны, пшеницы и других видов. В селективных системах с Na2S04 отобраны растения ячменя, табака и др., толерантные к сульфатному засолению. Ряд холодоустойчивых форм получен из клеток, выделенных in vitro по способности переживать инкубацию при низких положительных температурах.

Таблица 1.6

Примеры отбора толерантных к неблагоприятным природным условиям растений с использованием различных стрессовых факторов

Селективный фактор

Признак

Вид растения

NaCl

Устойчивость к хлоридному засолению

Пшеница, кукуруза, табак, люцерна

Na2S04

Устойчивость к сульфатному засолению

Ячмень, табак

Низкие положительные температуры

Холодоустойчивость

Рис, хризантема

Кислый pH и соли алюминия

Устойчивость к солям алюминия, способность расти на кислых почвах

Ячмень, рис, сорго

Аноксия

Устойчивость к корневому затоплению

Пшеница, сахарный тростник

Путем отбора клеток, устойчивых к низким значениям pH и солям алюминия, получены растения ячменя, риса и сорго, толерантные к этому металлу и успешно растущие на кислых почвах. С помощью метода клеточной селекции были получены растения кукурузы, устойчивые к гербицидам амидазолинону и сетоксидиму. В результате отбора клеток на средах с постепенно повышающимися концентрациями гербицидов были выделены клеточные линии, растения из которых выдерживали дозы гербицидов в 3—10 раз более высокие, чем исходные формы.

Иногда применяют специальные селективные системы, выбор которых основан на использовании специфических механизмов устойчивости (табл. 1.7).

Таблица 1.7

Примеры отбора устойчивых растений с помощью специальных селективных систем

Селективный фактор

Признак

Вид растения

Ь-азетидин-2-карбоновая кислота

Солеустойчивость

Рис, соя, табак

Тиазолидинкарбоновая кислота

Солеустойчивость

Люцерна, манго

Окончание табл. 1.7

Селективный фактор

Признак

Вид растения

Оксипролин

Солеустойчивость

Рис

Оксипролин

Морозоустойчивость

Пшеница, ячмень

Полиэтиленгликоль

Засухоустойчивость

Рис, кукуруза

Маннит

Засухоустойчивость

Пшеница, табак

Этионин

Солеустойчивость

Табак

Морская вода

Солеустойчивость

Пшеница, табак

Например, установлена положительная корреляция между накоплением в клетках пролина и повышением устойчивости растений к обезвоживанию, вызванному засолением, засухой или низкими температурами. Активность ферментов, катализирующих биосинтез пролина, ингибируется избытком продукта, что не дает возможности существенно повысить в тканях уровень этой аминокислоты. Для повышения эндогенного уровня пролина проводят селекцию на средах, содержащих его токсичные аналоги. В этих условиях выживают только те клетки, у которых ферменты биосинтеза пролина нечувствительны к ингибированию по типу обратной связи, и концентрация пролина увеличена. Путем отбора клеток в присутствии Ь-азетидин-2-карбоновой кислоты получены толерантные клеточные линии сои, табака и риса. На средах с другим аналогом пролина — тиазолидинкарбоновой кислотой удалось выделить устойчивые клетки люцерны и манго. Толерантные к оксипролину клеточные культуры и растения получены у риса, ячменя и пшеницы. Устойчивые к аналогам аминокислоты варианты характеризовались повышенным содержанием пролина и, как правило, были более устойчивы к NaCl, чем исходные формы. Растения пшеницы и ячменя, полученные путем клеточной селекции на среде с оксипро- лином, обладали повышенной морозоустойчивостью. Для отбора толерантных к холоду растений селекция на средах с пролином оказалась более эффективной, чем прямой отбор при пониженной температуре.

Засоление и низкая температура вызывают обезвоживание растительных тканей, поэтому увеличение способности клеток удерживать воду способствует повышению устойчивости к этим стрессовым факторам. Для отбора клонов, толерантных к обезвоживанию, используют среды с осмотиками: полиэтиленгликолем, маннитом, сорбитом. В селективной системе с ПЭГ были получены солеустойчивые клеточные линии и растения риса, а с использованием маннита — солеустойчивые растения табака и пшеницы.

Избыток соли нарушает метаболизм серы в растениях, вызывает уменьшение пула серосодержащих аминокислот цистеина и метионина. Нехватка этих аминокислот создает неблагоприятные условия для протекания сопряженных с метаболизмом серы путей биосинтеза азотистых соединений, углеводов и липидов. Суперпродукция метионина способна восполнить дефицит серы, возникающий в условиях засоления. Для отбора клеток с повышенной активностью биосинтеза метионина рекомендованы среды с его токсическим аналогом этионином.

Еще одним селективным фактором, имитирующим сульфатно-хлорид- ное засоление, является морская вода, добавленная к питательной среде в ингибирующих рост клеток дозах. Полученные из выживших на селективных средах каллусов растения табака и пшеницы были толерантны к токсичным для растений дикого типа концентрациям солей и характеризовались в стрессовых условиях повышенным содержанием пролина.

Каждая из перечисленных систем отбора солеустойчивых клеток имеет свои преимущества. В случае использования специальных селективных систем направленно отбираются варианты, солеустой- чивость которых обусловлена определенным механизмом. При проведении селекции на средах с хлоридом или сульфатом натрия разнообразие механизмов устойчивости у отселектированных форм будет значительно больше, хотя без специального исследования нельзя будет сказать, какова конкретная причина толерантности. Использование в качестве селективного фактора морской воды имеет практическую направленность на получение растений, для полива которых можно применять соленую воду.

Получение растений, устойчивых к болезням. Большим разнообразием характеризуются селективные системы, используемые для получения растений, устойчивых к патогенам. В тех случаях, когда поражающим фактором являются токсичные продукты жизнедеятельности патогенных грибов или бактерий, для отбора устойчивых клеток в питательную среду добавляют фильтрат культуральной жидкости возбудителя или очищенный токсин. Путем селекции на средах с культуральным фильтратом Fusarium или фузариевой кислотой получены растения люцерны, томатов, картофеля и пшеницы с повышенной устойчивостью к фузариозу. Отбор на средах с продуктами жизнедеятельности разных видов Helminthosporium позволил выделить формы пшеницы, кукурузы, ячменя и риса, невосприимчивые к гельминтоспорозу. Аналогичным образом получены растения табака, устойчивые к Pseudomonas syringae, растения картофеля, устойчивые к кольцевой гнили и другие невосприимчивые формы разных видов культурных растений.

Однако выделяемые патогенами токсины не всегда являются единственным или главным поражающим фактором. Поэтому устойчивость к токсинам может не коррелировать с устойчивостью к возбудителям болезней. В этом случае для отбора толерантных растений рекомендованы другие системы клеточной селекции. Одним из способов является инокуляция клеток каллусных культур спорами возбудителя болезни. После развития инфекции отбирают непораженные сектора и регенерируют из этих клеток растения. Таким способом были выделены растения риса, устойчивые к пирикуляриозу.

В связи с высокой скоростью мутирования патогенов, приводящей к возникновению новых рас, специфическая устойчивость растений по принципу «ген на ген» не может надолго их защитить. Поэтому большой интерес представляют различные виды неспецифической устойчивости, обусловленные характером взаимодействия паразита и хозяина. Например, для активного роста и спороношения грибы родов Phytophthora и Pythium нуждаются в определенных растительных стеринах. На растениях с нестандартным составом стеринов данные грибы не способны паразитировать. Для отбора таких растений культивируемые ткани картофеля подвергали действию полиеновых антибиотиков, в присутствии которых выживали только клетки с измененным соотношением стероидных соединений. Из резистентных к антибиотикам клеток были регенерированы растения, среди которых удалось отобрать образцы, устойчивые к фитофторе. Данная селективная система оказалась полезной и для создания растений, устойчивых к насекомым- вредителям, которые также нуждаются в стероидных соединениях растительного происхождения для осуществления линьки, метаморфоза личинок и формирования репродуктивной системы.

Другой подход к повышению устойчивости растений связан с ограничением проникновения в них патогенов. Одним из первых этапов заражения является разрушение клеточных стенок растений гидролитическими ферментами, продуцируемыми возбудителем. Было высказано предположение, что снижение чувствительности к пектиназе и целлюлазе повысит устойчивость к патогенам. По крайней мере, по отношению к пектиназе это предположение оказалось верным. Среди растений картофеля, регенерированных из каллусов на среде с пектиназой в сублетальной концентрации, были формы с повышенной устойчивостью к фитофторозу, черной ножке и кольцевой гнили. При этом до 15% регенерантов характеризовались невосприимчивостью одновременно к нескольким патогенам.

Одним из механизмов защиты от патогенных грибов является выделение растением различных ингибиторов. Большинство ингибиторов является фенольными соединениями или их окисленными формами. Накопление фенольных соединений и активация окисляющих их ферментов коррелирует с устойчивостью к патогену. Предшественниками в биосинтезе фенольных соединений являются фенилаланин и триптофан, поэтому обогащение клеток этими аминокислотами может привести к повышенной продукции фенольных соединений. Использование токсических аналогов аминокислот 5-метил-триптофана и парафторфе- нилаланина действительно позволило выделить клоны с суперпродукцией основной аминокислоты. У выделенных клонов активность защитных реакций была намного больше уровня в контрольных клонах.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >