Отбор трансформированных регенерантов

К сожалению, частота трансформации (отношение числа эксплантов с трансформированными побегами к общему числу эксплантов), независимо от использованных методов трансформации, достаточно мала. В связи с этим в генетической инженерии важное значение имеет возможность отбора трансформированных организмов.

Для этого используют селективные и маркерные гены. Наиболее распространенными селективными генами являются бактериальные гены устойчивости к антибиотикам (прокариотный ген неомицинфосфотранс- феразы nptll, придающий трансгенным растениям устойчивость к канами- цину, или hpt ген — устойчивость к гигромицину) или гены, делающие растения устойчивыми к гербицидам (bar — биалофосу; dh.fr — к метотрексату; esps — к Раундапу). При помещении эксплантов на среды, в которых присутствует селективный агент, образовавшиеся из трансформированных клеток побеги остаются живыми, а остальные погибают.

Однако использование селективных соединений имеет свои недостатки. Хотя селективные гены эффективно экспрессируются у большинства растений, но некоторые виды растений чрезвычайно чувствительны к селективным соединениям, что приводит к массовой гибели растительной ткани (даже трансформированной) на селективной среде. Другие же виды растений могут быть толерантны к высокой концентрации селективного фактора, что также затрудняет отбор трансформантов. Кроме того, эффективность отдельных соединений как селективных агентов способна меняться в зависимости от типа выбранного экспланта или вида ткани. Поэтому очень часто селективные факторы приходится подбирать эмпирически в зависимости от вида используемого экспланта.

В качестве маркерных генов часто используются какие-либо нерастительные гены, обусловливающие либо легко тестируемую энзиматическую активность (GUS, CAT, NOS и др.), либо гены-«репортеры» — индикаторные гены, применяемые при разработке систем трансформации для «транзиторной» кратковременной экспрессии при предварительном анализе конструируемых векторов, например, ген зеленого флуоресцирующего белка медузы (green fluorescent protein — gfp) или бактериальный ген gus, ферментный белок которого при взаимодействии со специальным субстратом окрашивает ткани растений в синий цвет. При использовании маркерных генов важными факторами являются простота, дешевизна и специфичность методов детектирования.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >