Доказательство трансгенности трансформированных растений

После первоначального отбора трансформированных растений или тканей с помощью маркерных или селективных генов необходимо доказать присутствие вводимого целевого гена с помощью молекулярных методов. Наиболее часто используют методы полимеразной цепной реакции (ПЦР — PCR) или ДНК-гибридизации (Саузерн-блоттинга — Southern-blotting).

Метод ПЦР заключается в том, что к анализируемому образцу ДНК добавляют в избытке 2 синтетических олигонуклеотида-праймера размером около 20 нуклеотидов. Каждый из них комплементарен одному из З’-концов фрагмента ДНК. ДНК нагревают (денатурируют) для разделения цепей двойной спирали, а при охлаждении происходит гибридизация праймеров с комплементарными участками фрагментов ДНК. В результате в растворе будут находиться однонитевые ДНК с короткими двухцепочечными участками—затравками (праймерами). При добавлении нуклеотидов и ДНК-полимеразы синтезируются комплементарные цепи и образуются идентичные фрагменты ДНК (первый цикл). Реакцию останавливают, и ДНК снова денатурируют прогреванием. В процессе охлаждения праймеры, находящиеся в избытке, вновь эффективно гибридизуются, но уже не только с цепями исходной ДНК, но и с вновь синтезированными. Внесение в систему ДНК-полимеразы инициирует второй цикл полимеразной реакции. Многократное повторение описанной процедуры позволяет провести 30 и более циклов ферментативного удлинения праймеров. При этом число сегментов ДНК, ограниченных с обоих концов используемыми праймерами, с каждым циклом ПЦР увеличивается экспоненциально (приближается к зависимости 2п, где п — число циклов). Выход всех других продуктов реакции увеличивается по линейной зависимости. Таким образом, в процессе рассматриваемой реакции эффективно амплифицируется только та последовательность ДНК, которая ограничена праймерами. Получаемый сегмент ДНК надежно выявляется в виде дискретной полосы после электрофоретического разделения молекул ДНК и окраски их этидиум бромидом.

Процедура Саузерн-блоттинга заключается в следующем — исследуемую ДНК подвергают денатурации и фиксируют на твердой подложке, например на нитроцеллюлозном или найлоновом фильтре. Меченый (радиоактивно или флуоресцентно) ДНК-зонд (обычно длиной от 100 до 1000 п.н.) тоже денатурируют, наносят на фильтр с исследуемой ДНК и проводят их отжиг. Для удаления негибридизовавшегося ДНК-зонда фильтр промывают и визуализируют метку. Если гибридизация между зондом и исследуемой ДНК не произошла, то никакой метки на фильтре не обнаруживается.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >