Обработка проб.
Взятые пробы очень редко содержат такое количество микроорганизмов, которое можно учесть, не прибегая к концентрированию или, напротив, разбавлению образца. Концентрированные образцы должны быть разбавлены до нужной плотности микроорганизмов с последующим высевом на питательные среды (подсчет живых клеток). Разведение проб осуществляют обычно в 10-кратных последовательностях, с тем чтобы на поверхность среды в чашке Петри попало 50 — 200 клеток, образующих колонии. При этом важно подобрать разбавитель, так как показано, что концентрация живых клеток может увеличиваться почти в два раза при высеве почвенных микроорганизмов из одной и той же пробы, если использовать разные солевые растворы для разведений. Разбавленные образцы должны быть сконцентрированы перед посевом. Для этой цели применяют центрифугирование или фильтрование через мембранные фильтры с заданным размером пор.
Если необходимо определить число живых микроорганизмов в пробе на момент ее отбора, необходимо учитывать возможность размножения клеток в образце во время хранения или транспортировки (феномен, известный как «эффект бутылки»), особенно важный для обработки проб морской воды, лишенных природных абсорбирующих поверхностей. Когда пробу морской воды помещают в стерильную посуду, питательные вещества воды сорбируются на внутренней поверхности сосуда, повышая локальную концентрацию субстратов. Это становится притягательным для микроорганизмов, которые также сорбируются на стенках и вследствие повышенной концентрации субстратов начинают быстро размножаться. С другой стороны, условия хранения собранных образцов могут привести к гибели части популяции микроорганизмов, что приведет к занижению общего микробного числа.
При разбавлении образцов микроорганизмы должны быть распределены в объеме пробы равномерно. Это сложная задача, особенно при обработке проб почвы или осадков, в которых микроорганизмы имеют тенденцию прикрепляться к частицам, органическим или минеральным. Степень десорбции клеток с частиц в значительной степени зависит от концентрации суспендирующего раствора и его химического состава, времени, температуры и силы перемешивания. Процесс оптимальной десорбции клеток с частиц сильно зависит от состава образца и поэтому требует абсолютной стандартизации методов и подготовки проб к посевам.
При концентрировании образцов важное место отводят выбору фильтра, так как фильтры с малыми порами быстро забиваются и не позволяют фильтровать пробы достаточных объемов, а фильтры с большими порами могут пропустить часть клеток. По- ликарбонантным фильтрам отдают предпочтение перед нитроцеллюлозными в силу более плоской поверхности и более унифицированных размеров пор. Химический состав материала фильтра влияет также на выживаемость микроорганизмов.
Несоблюдение условий, требуемых для той или иной физиологической группы микроорганизмов, при обработке проб может существенно изменить результат анализа. Так, обработка проб для выявления строгих анаэробов требует проведения всех разведений в растворах без кислорода и посева проб в бескислородной атмосфере. Для выявления психрофильных микроорганизмов вся стеклянная посуда и жидкости, соприкасающиеся с пробой, должны быть охлаждены для максимального сохранения жизнеспособных клеток психрофилов.
Если пробы не предназначены для определения числа живых и мертвых клеток, то их обычно фиксируют с помощью формальдегида или глутарового альдегида непосредственно после отбора. Такие препараты сразу готовы для прямого микроскопирования.
Сбор вирусных частиц из природных проб требует применения специальных методов их концентрирования. Вирусы можно сконцентрировать из водных образцов при неоднократной ад- сорбции/элюции подкисленных проб при пропускании их через эпоксидные, фиберглассовые или нитроцеллюлозные фильтры. Сорбированные частицы затем элюируют щелочными растворами. Процедуру можно неоднократно повторять, тысячекратно концентрируя вирусные частицы, например, из морской воды или проб осадков.
