Молекулярные аспекты биоинженерии. Генная инженерия

Общая характеристика

В геноме каждой живой клетки заложена генетическая программа, определяющая и контролирующая основные реакции клеточного метаболизма.

История развития генной инженерии насчитывает нс более тридцати лет. Ее становление связано с конструированием векторных молекул, получением рекомбинантных ДНК, а также включением в векторы генов животных и человека. Невозможно связать генную инженерию с одним каким-либо открытием, так как она представляет собой совокупность приемов и методов, направленных на создание искусственно модифицированных генетических программ. В предыдущей главе рассмотрены процессы генетической рекомбинации, происходящие при синтезе антител в природных условиях. Возможно эти процессы и явились толчком для проведения опытов, связанных с получением рекомбинантных генов искусственным путем.

Для проведения генно-инженерных процедур необходимо использование ряда узкоспециализированных методов. К ним относятся секве- нирование ДНК; получение фрагментов ДНК; выделение отдельных генов, необходимых для построения генетической программы; выбор и конструирование ген-несущего вектора; встраивание вектора в ДНК клетки-хозяина.

В указанных выше методах применяются следующие ферменты: эндонуклеазы или рестриктазы: обратная транскриптаза или ревертаза; ДНК-лигазы; экзонуклеазы; щелочная фосфатаза; полинуклеотидкиназа; концевая дезаксинуклеогидилтрансфераза; ДНК-полимераза.

Гены возможно получать методом химического синтеза, выделением из геномов живых организмов, а также при помощи обратной транскриптазы, которая на соответствующей мРНК кодирует комплементарную ДНК (кДНК). Первый и второй методы имеют ограниченное применение. Химический синтез — достаточно длительная и дорогостоящая процедура. Выделение однородных фрагментов ДНК осуществляется при помощи ферчентов-рестриктаз, которые узнают и расщепляют ДНК в строго фиксированных точках. Эти ферменты функционально связаны с модифицирующими метилазами следующим образом: метилазы осуществляют метилирование в сайтах ДНК, которые атакуются рестриктазами. Метилирование защищает собственную ДНК клетки от неспецифической фрагментации, в то время как чужеродная ДНК немедленно разрушается. В месте разрыва пол и нуклеотидных цепей образуются, в частности, липкие концы, способные образовывать между собой комплементарные пары оснований. Открытие В. Арбером рестрикции и использование ее для получения генов было отмечено Нобелевской премией. В настоящее время идентифицировано более 500 рестриктаз, причем их название складывается из первой буквы рода микроорганизма и двух первых букв вила, из которого выделена ресгриктаза. Например, фермент, выделенный из кишечной палочки Е. coli, называют Есо. При использовании фрагментов ДНК в качестве носителей генов следует учитывать то, что ДНК имеет мозаичную структуру, состоящую из интронов и экзонов, а клетка-реципиент, или компетентная клетка, как правило, лишена механизма сплайсинга.

Наибольшее распространение получил ферментативный метод получения генов. Из клеток выделяют суммарную фракцию матричных РНК, затем посредством иммунопреципитации осаждают мРНК, кодируемую геном, который является конечной целью выделения. Моновалентные антитела берутся из наборов или получаются в лабораторных условиях с помощью кодируемого целевым геном 2> на матрице мРНК синтезируется комплементарная кДНК. Однако для функционирования ревертазы необходима затравка. Для этого к мРНК добавляют полиТ, которая с З’-концевой полиА мРНК образует двухнепочечный участок, называемый шпилькой. Этот участок и является затравкой для действия ревертазы. Синтез второй цепи ДНК проводят при помощи обратной транскриптазы и фрагмента ДНК-полимеразы 1 (фрагмента Кленова), выделенной из Е. coli. Затем шпилька вырезается посредством нук- леазы S, и выделяется искусственно созданная двухцепочечная ДНК, кодирующая заданный белок. Для включения в плазмиду фрагмент ДНК снабжают липкими концами. К 3’-концам обеих цепей при помощи терминальной трансферазы присоединяют последовательности полиА размером 50—70 остатков аденина. После этого кДНК готова к включению в компетентную клетку. Если эта рекомбинантная ДНК попадет в клетки самостоятельно, она будет немедленно разрушена эндогенными рестриктазами, поэтому для ее доставки в клетки используют плазмиды, фаги или вирусы. Данные структуры называются векторами, и именно они переносят в клетку соответствующую генетическую информацию. Эти процедуры имеют первостепенное значение для генной инженерии, поэтому рассмотрим их более подробно.

Плазмиды представляют собой кольцевые ДНК, локализованные в бактериальных клетках. И хотя они занимают всего лишь несколько процентов генетического материала, их биологическая значимость достаточно велика. Они содержат информацию о резистентности к различным токсическим веществам, например к антибиотикам, а также участвуют в усвоении клеткой некоторых питательных веществ. В бактериальных клетках количество плазмид варьирует в пределах от единиц до сотни, причем их репликация автономна и не связана с репликацией хромосомы. Плазмиды являются гораздо более мобильным хранилищем генетического материала, чем хромосома, и при конъюгации клеток обмен генами происходит только за счет этих структур.

Нативная плазмида может быть использована в качестве вектора только после соответствующей модификации. Сначала ее переводят в линейную форму при помощи рестриктазы с образованием тупых концов. Для объединения с кДНК к З’-концам линейной плазмиды присоединяют концы, комплементарные концам кДНК, т. е. полиТ, или же создают специальные олигонуклеотиды — линкеры и адаптеры, способствующие образованию липких концов. Линкер присоединяют к ДНК, а затем при помощи соответствующей рестрик- тазы получают фрагмент ДНК с липкими концами. Для объединения фрагментов с разными липкими концами применяют последовательность нуклеотидов, называемую адаптером. В качестве векторов используют также ряд фагов, причем наиболее удобным является фаг X. Из вирусных частиц в качестве векторов чаще всего используют обезьяний вирус SV-40.

После получения вектора, соединенного с кДНК, можно приступать к трансформации компетентных, т. е. способных к трансформации, клеток. При взаимодействии векторов, нагруженных кДНК, с компетентными клетками в некоторые из них проникает чужеродная ДНК, что ведет к образованию трансформированных клеток. Эти клетки отбирают и клонируют с целью получения копий целевого гена. Идентификация клеток, несущих целевой ген, часто определяет успех проведения генно-инженерных разработок и проводится в два этапа.

« Отбор клеток, несущих вектор, сконструированный для данной генно- инженерной процедуры. Для облегчения отбора в вектор предварительно вводятся генетические маркеры, например гены устойчивости к антибиотикам. При высеве на среде с соответствующим антибиотиком данная бактериальная популяция будет нечувствительна к нему.

* Отбор клеток, несущих помимо вектора целевой ген. Для этой цели используют два варианта идентификации:

  • — непосредственный анализ ДНК-вектора в зоне искомого гена. Для этого (после получения одноцепочечного фрагмента) может быть использована полимеразная цепная реакция или гибридизация с мРНК, а также иные методы;
  • — отбор клеток, основанный на функциях внедренного в геном целевого гена. Например, по колируемому данным геном белку.

Имеются два типа векторов: обычные и специализированные. Обычные векторы клонирования дают возможность из огромного количества генов выбрать искомый и создать «библиотеку» генов, а специализированные связаны с экспрессией генов. Обычные векторы применяют в основном для выделения и изучения генов, входящих в состав генома различных клеток. Что касается специализированных векторов, то они представляют особый интерес для биотехнологии, так как экспрессия соответствующих генов дает основание для сверх синтеза целевых продуктов. Для этого ген, кодирующий необходимый белок, вводится в хромосому компетентных клеток и ассоциируется с промотором.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >