Препаративное хроматографическое разделение на колонках (красители, пигменты зеленых листьев)

Обычно для хроматографического разделения смеси веществ на оксиде алюминия применяют стеклянные колонки диаметром 8—10 мм и длиной 25—30 см. Применяют также бюретки соответствующих размеров, снабженные резиновой трубкой, винтовым зажимом и стеклянным наконечником или краном. Перед сборкой колонку тщательно моют, сушат, помещают в нижнюю часть тампон из стеклянной ваты и закрепляют в штативе так, чтобы под ней мог поместиться приемник — коническая колба на 25—30 мм (рис. 92).

Оксид алюминия для набивки колонки имеет марку «для хроматографии*. Степень ее активности не должна быть ниже III. Ее предварительно просеивают через сито с отверстиями 0,25 мм (или через сложенный вдвое капроновый чулок), помещают в коническую колбу и взмучивают в растворителе, который применяется при последующем разделении двух конкретных веществ. Полученную суспензию оксида алюминия вливают небольшими порциями в закрепленную в штативе колонку, непрерывно постукивая по ней куском толстостенного вакуумного каучука, чтобы обеспечить равномерное оседание адсорбента. Когда наполнение колонки окончено, с верхней части ее стенок смывают тем же растворителем оставшийся на них оксид алюминия. Верхний слой адсорбента должен быть достаточно плотным и ровным, иначе движущийся фронт вещества при разделении будет сильно искажен.

Когда оксид алюминия окончательно осядет, в верхнюю часть колонки (на 0,5 см выше поверхности оксида алюминия) помещают второй тампон из стеклянной ваты1. Растворитель должен вытекать из колонки

1 При последующем добавлении в колонку растворов хроматографируемых веществ этот тампон предохраняет оксид алюминия от взмучивания.

со скоростью 30—40 капель в минуту. Если слой оксида алюминия получается слишком плотным и нужная скорость прохождения раствора через колонку не будет достигаться, то ее увеличивают давлением воздуха на верхнюю часть колонки. Для этого верх колонки снабжают резиновой пробкой с трубкой, подключенной к системе со сжатым воздухом (давление не выше 0,5 атм). Когда уровень растворителя в колонке опустится до верхнего тампона из стеклянной ваты, в колонку вливают заранее приготовленный раствор смеси разделяемых веществ. Следует помнить, что во время работы оксид алюминия всегда должен быть покрыт растворителем.

Прибор для адсорбционной хроматографии с открытым нижним концом колонки для выталкивания адсорбента

Рис. 92. Прибор для адсорбционной хроматографии с открытым нижним концом колонки для выталкивания адсорбента

Разделение смеси флуоресцеина и метиленового синего. В колонку (d = 1 см) помещают описанным выше влажным способом наполнения 15 г оксида алюминия, суспендированного в 10 мл этанола. Когда уровень спирта достигнет верхнего тампона, в колонку сразу заливают раствор 20 мг смеси флуоресцеина и метиленового синего (в отношении приблизительно 1:1) в 10 мл этанола. По мере прохождения раствора по колонке появляется полоса метиленового синего, которая спустя некоторое время полностью отделяется от зеленовато-желтого слоя флуоресцеина. Когда уровень спирта достигнет верхнего тампона, в колонку добавляют этанол порциями по 2—3 мл до тех пор, пока весь метиленовый синий не пройдет из колонки в приемник. Затем приемник заменяют и в колонку добавляют порциями по 2—5 мл воду до тех пор, пока во второй приемник полностью не перейдет флуоресцеин. Полученные растворы выпаривают, взвешивают выделившиеся красители и определяют соотношение их в исходной смеси, а также общий выход.

Разделение смеси метилового оранжевого и метиленового синего. Проводится по описанной выше методике (см. разделение флуоресцеина и метиленового синего). Для разделения берут раствор 10 мг метилового оранжевого и 30 мг метиленового синего в 15 мл этанола. Метиленовый синий вымывают этанолом, а метиловый оранжевый — водой.

Разделение смеси кристаллического фиолетового и малахитового зеленого. Проводится по той же методике. Для разделения используют раствор смеси 50 мг кристаллического фиолетового и 50 мг малахитового зеленого. В качестве жидкости при наполнении колонки используют воду. Она же применяется для последующего вымывания обоих красителей.

Разделение пигментов зеленых листьев на колонке с несколькими адсорбентами. Сушат 4—5 свежих листьев или горсть травы 1 ч при 40 °С или сутки при 20 °С. Мелко измельчают и встряхивают 1 ч со смесью 90 мл петролейного эфира,

  • 10 мл бензола и 30 мл этанола. Фильтруют и промывают фильтрат 4 раза по 50 мл воды. Сушат сульфатом натрия и упаривают на водяной бане до объема 5 мл.
  • 113
  • 8- 1328

В отдельных конических колбах встряхивают 8 г оксида алюминия II степени активности, 5,3 г карбоната кальция и 7 г сахарозы с 15, 30 и 20 мл петролейного эфира соответственно.

На нижнюю часть колонки (см. рис. 92) надевают кусок медной сетки и закрепляют его. Помещают на сетку ватную пробку и заполняют колонку влажным способом (как описано выше для оксида алюминия) следующим образом. Вносят оксид алюминия и на его поверхность кладут кружок фильтровальной бумаги. Затем вносят суспензию карбоната кальция, снова кружок и сахарозу. Из капельной воронки вводят экстракт пигментов. Промывают смесью бензол — петролейный эфир (1:4). В колонке проявляются полосы (снизу вверх): ярко-оранжевая (на А1203) — каротины; желтая (на СаС03) — ксантофиллы, сине-зеленая (на сахарозе или СаС03) — хлорофилл а; ярко-зеленая (на сахарозе) — хлорофилл б.

Через колонку просасывают воздух для сушки, затем удаляют медную сетку и выталкивают адсорбенты на фильтровальную бумагу. Из каждой порции адсорбента элюируют пигменты смесью эфира с метанолом (50:1).

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >