Разделение аминокислот с помощью распределительной хроматографии на бумаге

Цель данной работы — разделить и идентифицировать аминокислоты, смесь которых дана в виде раствора. Задача разработана для глицина, аланина, валина и фенилаланина.

Прибор для выполнения восходящих хроматограмм представляет собой цилиндр с крышкой, снабженной резиновой прокладкой. Можно использовать также мерный цилиндр вместимостью 1 л.

Перед работой получают у преподавателя контрольную задачу — раствор двух неизвестных аминокислот, а у лаборанта — лист хроматографической бумаги, отрезанный по размеру цилиндра, и расчерчивают его карандашом так, как показано на рис. 93, а. ? Осторожно! Брать бумагу только тщательно вымытыми руками. Иначе при хроматографировании обнаружатся пятна аминокислот от вашего пота.? По линейке проводят на расстоянии 2 см от нижнего обреза горизонтальную прямую АВ. Рисуют кружки диаметром 3 мм на расстоянии 2 см друг от друга и ставят над ними порядковые номера.

Растворы аминокислот на бумагу наносят на отдельном столе. Бумагу кладут на предварительно тщательно вымытое стекло. Под нижний край бумаги подкладывают стеклянную пластинку или тетрадку так, чтобы та часть бумаги, где нарисованы кружки, оставалась на весу и не касалась поверхности стекла. Капиллярами, специально приготовленными для каждого раствора, на бумагу в кружки последовательно наносят капли растворов исследуемых смесей аминокислот и ?свидетелей». Наносимая капля не должна распространяться за пределы нарисованного кружка. Раствор на каждый кружок наносят 5—6 раз после высыхания предыдущей капли.

После высыхания нанесенных капель тщательно моют руки с мылом, свертывают бумагу в цилиндр и сшивают лист через край так, чтобы края не накладывались друг на друга и чтобы получился более или менее правильный цилиндр. Особое внимание обращают на то, чтобы при сшивании точки А и В совпали. На дно стеклянного цилиндра ? осторожно, не замочить стенки! 4 наливают смесь «-бутилового спирта, уксусной кислоты и воды (4:1:5). Высота слоя растворителя не выше 1 см от дна цилиндра (рис. 93, б, в).

Бумажный цилиндр осторожно вставляют вертикально в стеклянный цилиндр так, чтобы он не касался стенок и чтобы нанесенные капли находились на нижнем конце бумажного цилиндра. Для лучшей центровки бумажного цилиндра в стеклянном часто помещают мятую фильтровальную бумагу между стенками бумажного и стеклянного цилиндров в верхней их части.

Стеклянный цилиндр плотно закрывают крышкой с резиновой прокладкой и оставляют стоять до тех пор, пока растворитель поднимется почти до верхнего края. Тогда осторожно вынимают бумажный цилиндр, помечают карандашом границу фронта растворителя, разрезают шов, выпрямляют бумагу и вешают ее для просушки под тягу или в сушильный шкаф (70—80 °С).

Когда растворитель полностью испарится, хроматограмму проявляют. В качестве проявителя для а-аминокислот применяют 0,5%-й раствор нингидрина в метаноле или ацетоне. Этим раствором опрыскивают хроматограмму несколько раз из пульверизатора так, чтобы бумага становилась только слабо

влажной и на ней не образовывались бы размывающие струйки раствора. Затем сушат ее на воздухе и прогревают в сушильном шкафу при 110 °С до появления лиловых пятен. Значительно лучше просушить хроматограмму постепенно в темноте. Проявившиеся пятна легко обводят карандашом и при желании закрепляют раствором сульфата никеля, после чего еще раз просушивают хроматограмму на воздухе.

Качественный состав контрольной смеси аминокислот определяют по значению Rf каждого пятна, сравнивая с Rf, вычисленными по хроматограмме для ?свидетелей». Значения Rf аминокислот в этой системе: глицин 0,13; аланин 0,18; валин 0,36; фенилаланин 0,46.

В этом варианте задачу можно выполнить и для других аминокислот (табл. 11), а также для простейших углеводов (табл. 12). При хроматографировании углеводов их проявляют аммиачным раствором нитрата серебра (черное пятно). [1]

Таблица 11. Rf простейших аминокислот при хроматографировании на бумаге типа «быстрая» в различных растворителях

Аминокислота

Р

II

III

IV

V

VI

VII

VIII

IX

Глицин

0,45

0,07

0,02

0,03

0,36

0,44

0,28

0,41

0,15

Аланин

0,55

0,10

0,03

0,05

0,44

0,67

0,43

0,54

0,24

Норвалин

0,22

0,12

0,19

0,71

Валин

0,62

0,18

0,11

0,15

0,65

0,73

0,64

0,65

0,43

Изолейцин

0,67

0,31

0,18

0,27

0,76

0,78

0,71

0,66

0,43

Лейцин

0,69

0,36

0,21

0,31

0,78

0,78

0,72

0,68

0,43

Фенилаланин

0,64

0,36

0,36

0,33

0,79

0.73

0,66

0,66

0,52

Серин

0,47

0,08

0,01

0,02

0,34

0,48

0,34

0,51

0,14

Пролин

0,58

0,11

0,12

0,12

0,57

0.73

0,49

0,56

0,42

Триптофан

0,58

0,30

0,78

0,70

0,63

0,43

Орнитин

0,16

0,02

0,00

0,00

0,24

0,30

0,31

0,29

0,10

Лизин

0,02

0,00

0,01

Аспарагиновая кислота

0,45

0,02

0,00

0,00

0,31

0,38

0,15

0,48

0,07

Глутаминовая кислота

0,51

0,02

0,00

0,01

0,38

0,45

0,19

0,48

0,09

Цистин

0,02

0,00

0,00

0,25

0,20

0,06

Таблица 12. Rf простейших углеводов и родственных им соединений при хроматографировании на бумаге типа «быстрая»

Соединение

I[2]

II

III

IV

D-Глюкоза

0,18

0,13

0,16

0,45

D-Галактоза

0,16

0,14

0,12

0,41

D-Манноза

0,20

0,15

0,22

0,49

L-Сорбоза

0,20

0,16

D-Фруктоза

0,23

0,18

0,21

0,48

D-Ксилоза

0,28

0,19

0,29

0,54

D-Арабиноза

0,21

0,21

0,22

0,48

D-Рибоза

0,31

0,22

D-Дезоксирибоза

0,32

Лактоза

0,09

0,07

0,03

0,34

Мальтоза

0,11

0,08

0,07

0,39

Сахароза

0,14

Аскорбиновая кислота

0,38

0,19

1 Системы растворителей: I — н-бутанол — уксусная кислота — вода (4:1:5); II — изомасляная кислота; III — лутидин — mpem-амиловый спирт — вода (7:7:6); IV — пиридин — изоамиловый спирт — вода (7:7:6).

  • [1] Системы растворителей: I — ацетон — вода (3:2), II — трет-амиловый спирт; III — бензиловый спирт; IV — н-бутанол — бензиловыйспирт (1:1); V — изомасляная кислота; VI — тетрагидрофуран — вода(3:2); VII — тетрагидрофурфуриловый спирт — вода (4:1); VIII — пиридин — вода (65:35); IX — тетрагидрофурфуриловый спирт — пиридин —вода (67:8:25).
  • [2] 2 См. часть 1, раздел 12.
 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >