Афинная хроматография.

Метод афинной хроматографии также основан на сорбционных процессах, но отличается от других видов хроматографии особой избирательностью действия. Этот метод используют для разделения макромолекул, таких как полипептиды, белки, ферменты и пр. В молекулах этих соединений обычно есть определенные участки, способные образовывать комплексы с различными лигандами.

Зная эту особенность, нужные лиганды закрепляют на неподвижной матрице, а исследуемую смесь пропускают через колонку. В качестве неподвижной фазы обычно используют различные гели типа сефадекса, триса- крила и др. Подвижной фазой чаще всего являются буферные растворы: ацетатный или фосфатный.

При прохождении через колонку отделяемое вещество (целевой компонент) комплементарно связывается со специфичным но отношению к нему лигандом и задерживается неподвижной фазой, а другие компоненты смеси удаляются из колонки. Например, аминокислотные остатки Гис и Три комплементарно соединяются с иминодиацетатными группами.

В молекулах биополимеров комплексообразующие центры часто находятся не на поверхности, а в глубине структуры и недоступны для лиганда, закрепленного на матрице. Чтобы преодолеть эту трудность, лиганды пришивают к неподвижной фазе через дополнительный белок — спейсер (от англ, spacer — разделитель).

Снятие евзанного компонента с матрицы осуществляют разными способами:

  • • внесение элюента с пониженным значением pH, что приводит к диссоциации отделяемого компонента от лиганда за счет протонирования активных групп и комплексообразующего центра;
  • • использование элюента, содержащего вещество, способное образовать с лигандом более устойчивый комплекс, чем целевой компонент (так называемый лигандиый обмен);
  • • использование элюента, сочетающего в себе особенности двух предыдущих вариантов — и пониженное значение pH, и агент, образующий комплекс с лигандом.

Если изменять диапазон pH элюента или вводить в него некоторые ионы (SCN , CF3COO , СЮ4, СС1300 ), этим можно контролировать прочность соединения целевого компонента с лигандом.

Метод афинной хроматографии широко применяется не только в научных исследованиях, но и в промышленном производстве.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >