Меню
Главная
Авторизация/Регистрация
 
Главная arrow Математика, химия, физика arrow БИОХИМИЯ ДЛЯ ТЕХНОЛОГОВ в 2 ч. Часть 1.
Посмотреть оригинал

Строение белковых молекул

В настоящее время белковые молекулы изучены достаточно хорошо. На основе имеющихся данных сформулировано современное определение белков.

Белки — это высокомолекулярные органические соединения, построенные из аминокислот, соединенных пептидными связями, и имеющие большую молекулярную массу и сложную структурную организацию.

Исходя из методических соображений, в строении белковых молекул выделяют несколько уровней организации: первичный, вторичный, третичный и четвертичный.

Первичная структура

Формирование белковых молекул начинается с соединения аминокислот друг с другом. Это первый уровень или первичная структура белка.

Первичная структура белка — это нолинентидная цепь, в которой аминокислоты соединены пептидными связями.

Установление первичной структуры белка требует выполнения нескольких операций в определенной последовательности, которые перечислены в табл. 4.2.

Алгоритм действий при определении первичной структуры белка

Выполняемая операция

Цель и сущность превращения

Разрыв S-S-мости ков (если они есть)

Разворачивание полипептидной цепи. Осуществляют окислением S—S-мостиков иадмуравьиной кислотой до SO:jH-rpynn, которые не разрушаются при дальнейшем анализе

Частичный гидролиз но- линеитидных цепей

Укорачивание аминокислотных последовательностей, что облегчает их дальнейшую расшифровку. Осуществляют селективным ферментативным гидролизом (трипсином или химотрипсином) или химическими агентами (бром- циаиом, 2,4-динитрофторбензолом и др.)

Фракционирование полученных пептидов

Отделение полученных полипептидиых цепей друг от друга. Осуществляют методом электрофореза

Расшифровка аминокислотной последовательности в коротких пептидах

Определение первичной структуры в отдельных поли- пептидных цепях. Осуществляют масс-спектрометричес- ким методом или с использованием секвенатора

Установление первичной структуры белка

Воссоздание первичной структуры белка на основании полученных данных

В настоящее время определение аминокислотных последовательностей в пептидах и белках практически полностью автоматизировано. Это результат огромного труда отдельных ученых и многих научных коллективов, благодаря которым стало возможным использование приборов и аппаратов в сложном процессе расшифровки первичной структуры белка.

Первым белком, аминокислотную последовательность которого удалось выяснить, стал инсулин, а первооткрывателем — английский биохимик Фредерик Сенгер (1918—2013). Он проделал эту работу фактически вручную. Выделял белок в чистом виде, фрагментировал его на несколько пептидов, которые разделял с помощью хроматографии, а затем идентифицировал состав и последовательность каждого пептида. Постепенно соединяя отдельные короткие фрагменты, Сенгер прочел последовательность из 54 аминокислотных остатков. На эту работу ушло восемь лет, но она послужила основой для разработки современных методов определения первичной структуры белка. И в наши дни для расшифровки последовательности аминокислот пошагово выполняют те же операции, которые осуществлял Ф. Сенгер.

Наиболее длительным и трудоемким является непосредственно этап расшифровки и восстановления аминокислотной последовательности. Для решения этой задачи существует несколько подходов: анализ концевых групп и метод перекрывающихся пептидов.

При анализе концевых групп пользуются разными методиками.

Одна из них подразумевает использование ферментов амино- и карбок- сипептидаз (см. рис. 6.35). В этом случае от исследуемого пептида последовательно отщепляют N- или С-концевую аминокислоту, в зависимости от вида используемого фермента, и направляют ее на идентификацию. Оставшийся пептид снова подвергают действию той же пептидазы. Так повторяют до тех пор, пока весь пептид не разделят на отдельные аминокислоты.

В другом случае концевые аминокислоты отделяют без участия ферментов, а с помощью химических реагентов. Как, например, это было предложено в 1951 г. Ф. Сейгером. Он связывал N-концсвую аминокислоту 2,4-динитро- фторбензолом, а затем гидролизовал пептид. Только N-концевая аминокислота в этом случае находится в виде производного 2,4-динитрофторбензола. Широкое применение нашел разработанный шведским биохимиком П. Эдма- ном метод связывания N-концевых аминокислот феньттиоизоцианатом. Японский химик-органик и биохимик С. Акабори использовал гидразин для определения аминокислотной последовательности в белках с С-конца пептида.

Многократное последовательное повторение анализа с использованием ферментов или химических реагентов дает в итоге последовательность во всем белке. В наше время этими способами определяют первичную структуру в пептидах длиной в несколько десятков аминокислот.

При определении аминокислотной последовательности методом перекрывающихся пептидов предварительно применяют два различных варианта гидролиза пептидов: расщепление химическими реагентами и действие протеолитических ферментов. Каждый протеолитический фермент специфичен по отношению к определенной пептидной связи. Место его действия принято обозначать тем аминокислотным остатком, которому принадлежит карбонильная группа. Например, пепсин и химотрипсин расщепляют связи, образованные Фен, Тир и Три, а трипсин — Apr и Лиз. Некоторые химические реагенты также избирательно действуют на пептидные связи. Бромциан (CNBr) гидролизует связи Мет-Ала и Мет-Тир.

Полученные пептиды разделяют и очищают, устанавливают в них последовательность аминокислот. А затем из полученных фрагментов восстанавливают общую аминокислотную последовательность, примерно так, как из обрывков слов можно восстановить фразу.

Схематичное изображение первичной структуры такое же, как у полипептида, но если учесть, что валентные углы между атомами не равны 90°, то становится ясно, что это ритмично изогнутая в пространстве цепь аминокислотных остатков (рис. 4.1).

Электронное строение, энергия, длина, валентные углы как самой пептидной, так и прилегающих к ней связей хорошо изучены. Опираясь на эти знания, можно описать ряд особенностей пептидной связи (табл. 4.3).

По своей природе пептидная связь является ковалентной, т.е. одной из самых прочных, что обеспечивает высокую стабильность первичной структуры. Это своего рода защитное свойство. Ведь в природных условиях соединение аминокислот в полипептидиую цепь происходит не хаотично, а по матрице генетического кода. Другими словами, первичная структура — последовательность аминокислот, подаренная нам природой. Каждый белок обладает характерными для него свойствами только до тех пор, пока сохраняется индивидуальное для него чередование аминокислот.

Например, структуры нанопептидов окситоцина и вазопрессина различаются двумя аминокислотами (рис. 4.2). При этом окситоцип ускоряет сокращения гладких мышц, а вазопрессин является антидиуретическим гормоном, так как регулирует водный баланс организма и осмотическое давление крови. Однако оба гормона принимают участие в регуляции секреции молока.

Стоит заменить хотя бы одну аминокислоту среди десятков или даже сотен в полииеитидной цепи, как белок утрачивает свои функции или приобретает другие свойства.

Способы изображения первичной структуры белка

Рис. 4.1. Способы изображения первичной структуры белка:

а — прямолинейный; б — изогнутый; в — упрощенный изогнутый (не указываются атомы С в цепи); прямоугольниками выделены пептидные связи, окружностями — N- и С-кон-

цевые аминокислоты

Особенности пептидной связи

Таблица 43

Свойство

Характеристика

Компланарность

Атомы (С, О, N и Н), образующие пептидную связь, лежат в одной плоскости, а радикалы аминокислотных остатков — иод углом 109° к этой плоскости

Способность существовать в двух изомерных формах — кето- ii енольной

О-—^ ОН

!h Л 1

-C-N ^ — C=N— (§)

кето-форма енол-форма

Возможность образовывать водородные связи (выделены гремя точками)

X

/

0

' X 1 .

  • -1—и
  • 0=0
  • 1

__ х—ъ

f—

/° i

Транс-положение заместителей по отношению к С—N-связи

о ®

II 1

  • -----CH--C-N-CH-----
  • 1 1 ® н
Биогенные нанопептиды, выполняют гормональную функцию

Рис. 4.2. Биогенные нанопептиды, выполняют гормональную функцию:

а — окситоцин; 6 — вазопрессин

Например, с возрастом в результате генетической мутации у человека может синтезироваться белок аполипопротеин с измененной первичной структурой. В норме 61-й аминокислотой является Apr, 109-й — Глу, а 112-й — Цис. Между положительно заряженным радикалом Apr и отрицательной ионизированной группой Глу возникает солевой мостик, придающий определенную форму этому белку, что способствует связыванию Л ПВП, в чем и заключается его функция. В мутированном белке происходит всего лишь одна замена. Вместо 112-го Цис встраивается Apr. Теперь солевой мостик образуется между близко расположенными Глу109 и Арг112, но одновременно утрачивается сродство к ЛПВП и аполипопротеин начинает транспортировать ЛПОНП, что способствует развитию атеросклероза в организме человека.

Можно привести пример с пищевым белком, который также наглядно демонстрирует, как измененная первичная структура влияет на его физикохимические и технологические свойства. В белках молока выделяют несколько фракций. Фракцией, обеспечивающей стабильность молочных белков в растворенном состоянии, является к-казеин. В его структуре обнаружено два генетических варианта: А и В, различающиеся лишь одной аминокислотой из 169 в позиции 148. В модификации к-казеина В — это Ала, в модификации к-казеина А — Аси. Замена только одной аминокислоты сказывается на технологических свойствах казеина. Поскольку радикал Асп имеет заряд, то A-модификация к-казеина дольше находится в ионизированном состоянии и хуже осаждается. И наоборот, нейтральный Ала1/{8 в модификации В способствует уменьшению общего заряда к-казеина, а значит, и его гидратации. Поэтому наличие к-казеина В обусловливает лучшую способность молока к свертыванию за счет уменьшения времени образования сгустка, получения сгустка большей плотности и прочности и, как следствие, снижение потерь белка, вызванное его отходом в сыворотку. Это имеет очень существенное значение в производстве таких молочных продуктов, как сыр и творог [26].

В производстве пищевых продуктов, как правило, не требуется полностью сохранять нативные свойства белков. Многие технологические приемы направлены на разрушение первичной структуры белков до пептидов и отдельных аминокислот. Это придает получаемому продукту новые физико-химические, органолептические свойства и облегчает процесс переваривания белков, которые усваиваются только после гидролиза до аминокислот.

 
Посмотреть оригинал
< Предыдущая   СОДЕРЖАНИЕ   Следующая >
 

Популярные страницы