Молекулярные основы генетической инженерии

Генетическая инженерия представляет собой конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или, иначе, — создание искусственных генетических программ (академик А.А Баев). По Э.С. Пирузян, генетическая инженерия — это система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать

Двойная спираль ДНК

Рис. 4.1. Двойная спираль ДНК

лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных, или гибридных, молекул ДНК. Следовательно, основным объектом генетической инженерии является молекула ДНК, в которой закодирована вся информация о строении и функционировании любой живой клетки.

ДНК — это полимерная двухцепочечная молекула, построенная по принципу комплементарности (рис. 4.1). Комплемен- тарность обеспечивает, во-первых, стабильность молекулы, во-вторых, — точное воспроизведение при построении дочерних цепочек. Мономером ДНК служат четыре типа нуклеотидов, каждый из которых состоит из сахара — дезоксирибозы, фосфатной группы и азотистого основания. Нуклеотиды различают по азотистым основаниям, которые подразделяют на две группы: пуриновые (аденин и гуанин) и пиримидиновые (цитозин и тимин); в молекулах другой нуклеиновой кислоты — РНК — вместо тимина встречается урацил (рис. 4.2). Между пуриновыми и пиримидиновыми основаниями возникают комплементарные взаимодействия (А — Т и Г — Ц), которые удерживают цепочки, состоящие из дезоксирибозы и фосфатной группы, относительно друг друга.

Размер молекулы ДНК измеряется числом пар комплементарных нуклеотидов — от нескольких тысяч пар нуклеотидов (т. п. н.) до миллионов пар нуклеотидов (м. п. н.). У человека длина ДНК, составляющей первую хромосому, составляет 263 м. п. н.

Молекулы ДНК представляют собой генетическую информацию, важной единицей которой являются гены — элементарные носители, кодирующие информацию о синтезе одного определенного продукта. Поэтому каждый ген характеризуется строго определенной последовательностью нуклеотидов. Большая часть генов содержит информацию о строении белков, а некоторые кодируют только определенные молекулы РНК (например, рибосомальную РНК).

Пуриновые (а) и пиримидиновые (б) азотистые основания (по В.П. Комову и В.Н. Шведовой, 2004)

Рис. 4.2. Пуриновые (а) и пиримидиновые (б) азотистые основания (по В.П. Комову и В.Н. Шведовой, 2004)

Как уже отмечалось, в основе генетической инженерии лежит целенаправленное конструирование искусственных генетических систем вне организма и их введение в живой организм с целью создания нового организма (или модификации существующего). Это предполагает, что часть генов можно с помощью специальных ферментов вырезать из молекулы ДНК одного организма (донорная ДНК) и перенести в другой, реципиентный, организм. Такой перенос генов называется трансгенозом, а организмы, в ДНК которых включены чужеродные гены, носят название трансгенных.

Используемые для переноса генетические конструкции носят название рекомбинантных ДНК. В их состав входят фрагмент донорной ДНК (клонируемая ДНК) и векторная ДНК (вектор, который отвечает за перенесение и встраивание — интеграцию — клонируемой ДНК). Молекулы рекомбинантной ДНК создают для клонирования необходимых участков ДНК, картирования ДНК, создания трансгенных организмов, массового получения продуктов, закодированных данным участком ДНК. Рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата реципиент- ного организма и обеспечивают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.

Технология получения рекомбинантных ДНК включает следующие методические подходы:

  • 1. Специфическое расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами.
  • 2. Быстрое секвенирование всех нуклеотидов в определенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и кодируемую им аминокислотную последовательность.
  • 3. Конструирование рекомбинантной ДНК.
  • 4. Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять с большой точностью и чувствительностью специфические последовательности РНК или ДНК, основанные на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот.
  • 5. Клонирование ДНК путем введения ее фрагмента в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий, или амплификация in vitro; создание геномных библиотек.
  • 6. Введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.

Остановимся на этих технологиях более подробно.

Ферменты

Большинство ферментов выделяют из клеток бактерий и используют для «разрезания» или «сшивания» ДНК как прокариотических, так и эукариотических клеток.

Применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК ферменты можно подразделить на несколько групп:

  • — ферменты, с помощью которых выделяют фрагменты ДНК (рестриктазы);
  • — ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (ДНК-полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы, ревертазы );
  • — ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);
  • — ферменты, изменяющие строение концов фрагментов ДНК.

Рестриктазы (эндонуклеазы рестрикции) — ферменты, с помощью которых выделяют фрагменты ДНК. Эти высокоспецифичные ферменты узнают и расщепляют определенные последовательности азотистых оснований в молекуле ДНК (сайты рестрикции). В генетической инженерии рестриктазы предназначены для вырезания необходимых участков из молекул донорной ДНК.

Рестриктазы выделяют из бактерий, но они также выявлены у дрожжей и одноклеточных водорослей. Номенклатура рестриктаз была предложена в 1973 г. С. Смитом и Д. Натансом. В соответствии с ней названия ферментам дают по тем бактериям, из которых они были выделены. Первая буква названия обозначает род микроорганизма, две следующие — его вид; далее идет порядковый номер данной рестриктазы в ряду других эндонуклеаз, выделенных из данного организма. Например: рестриктазы Нра I, Нра II — ферменты, выделенные из Haemophilus parainfluenzae; Eco RI — рестриктаза, выделенная из Е. coli. Иногда вставляют еще одну, четвертую, латинскую букву — как указатель штамма бактерий: Hind III — из Haemophilus influenzae. Если защитная система бактериальной клетки (система рестрикции — модификации) локализована в плазмиде, то указывают символ плазмиды — R, например: Eco RI.

Естественной функцией рестриктаз является защита бактерии от чужеродной ДНК (прежде всего от ДНК бактериофагов, которая может проникнуть в клетку и вызвать ее трансформацию). Они ограничивают возможность размножения фаговой ДНК, разрезая ее на части. Фермент рестрикции не может разрезать свою собственную ДНК, так как бактериальная ДНК модифицирована метилированием, осуществляемым ферментом ДНК-метилазой.

Образование в ДНК «тупых» (а) и «липких» (б) концов под действием рестриктаз (по А.С. Коничеву и Г.А. Севастьяновой, 2003)

Рис. 4.3. Образование в ДНК «тупых» (а) и «липких» (б) концов под действием рестриктаз (по А.С. Коничеву и Г.А. Севастьяновой, 2003)

Определенные рестрикта- зы узнают в ДНК последовательности из нескольких (от четырех до восьми) нуклеотидов, осуществляя либо несимметричные, либо симметричные разрывы. При расщеплении молекула ДНК разрезается с образованием так называемых «липких» или «тупых» концов (рис. 4.3). «Липкие» концы образуются, когда разрывы в разных цепочках ДНК происходят со смещением друг относительно друга (рестрик- тазы Eco RI; Hind III), а «тупые» — когда разрывы в цепочках возникают друг против друга (рестриктазы Taq I; Нра I; Sma I). В настоящее время выделено свыше 2000

рестриктаз, которые могут узнавать более 150 сайтов рестрикции.

Обратные транскриптазы, ДНК-полимеразы — ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК. В генетической инженерии часто используется ДНК-полимераза I, выделенная А. Корнбергом и сотрудниками в 1958 г. из клеток Е. coli. Этот фермент имеет трехдоменную структуру. При удалении N-концевого домена оставшаяся часть молекулы (фрагмент Кленова) сохраняет характерные для нее каталитические свойства. ДНК-полимераза в естественных условиях в клетке играет важную роль в репарации (восстановлении структуры) поврежденной ДНК, осуществляя так называемую ник-трансляцию (ник — разрыв в одной из цепей ДНК).

РНК-зависимая ДНК-полимераза, ревертаза — это ферменты, которые используют для синтеза комплементарной цепи ДНК с мРНК. Впервые их выделили Г. Темин и С. Ми- зутани в 1970 г. из вируса саркомы Рауса. Полученную двухцепочечную комплементарную молекулу ДНК (кДНК) можно затем встраивать в векторы, размножать в составе гибридных молекул ДНК и использовать для дальнейших исследований. Таким способом можно создавать кДНК-биб- лиотеки. Следует отметить, что молекулы кДНК не содержат интронов, что позволяет клонировать ДНК эукариот в прокариотических системах.

Лигазы — ферменты, которые «сшивают» фрагменты ДНК за счет фосфодиэфирных связей, образующихся между З'-гидроксильной концевой группой одного фрагмента ДНК и 5'-фосфатной группой другого фрагмента.

Из двух типов существующих лигаз для лигирования фрагментов ДНК обычно используют более универсальную лигазу фага Т4, которая может «сшивать» как «липкие», так и «тупые» концы. ДНК-лигазы необходимы в естественных условиях в процессах репарации ДНК и репликации — при удвоении цепи ДНК.

Ферменты, изменяющие строение концов фрагментов ДНК. Например, щелочная фосфатаза отщепляет от линейного фрагмента молекулы ДНК 5'-фосфатные группировки, что значительно снижает, количество образующихся случайных, нежелательных комбинаций фрагментов ДНК (в том числе тех, которые могут образоваться под действием ДНК-лигазы). Нуклеаза Ва1 31 — это фермент, неспецифически удаляющий нуклеотиды из последовательности ДНК. Он позволяет «подтупить» несимметричные концы ДНК либо укоротить фрагменты ДНК, сближая их функционально значимые элементы.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >