Хроматографические методы, применяемые на стадии тонкой очистки

После стадии концентрирования получается продукт или сырец, содержащий 50—80% целевого вещества. На заключительных стадиях выделения и очистки применяют различные хроматографические методы.

Молекулярно-ситовая хроматография. При данном виде хроматографии используется способность материалов с контролируемой пористостью сортировать и разделять компоненты смеси в соответствии с размерами и формой их молекул. Для осуществления процесса гель-хроматографии используются гели поперечно-емкостного декстрана (сефадексы и сефакрилы), поперечно-сшитые полиакриламидные гранулы (биогели), агарозные гели с выраженными в них цепями акриламидного полимера (ультрагели) и более жесткие поперечно-сшитые агарозы (CL-агарозы и сефакрилы-S), с помощью которых можно быстро разделить макромолекулы в соответствии с их размером. Степень удерживания растворенного вещества на колонке зависит от его способности проникать в поры геля. Поэтому при гель-фильтрации сначала выходят высокомолекулярные вещества, а затем вещества в порядке убывания их молекулярных масс, т. е. гель выполняет роль молекулярного сита. Этот способ особенно эффективен на заключительных стадиях выделения и очистки веществ.

Аффинная хроматография. Данный метод заключается в использовании иммобилизованного на матрице специфического соединения — лиганда, способного специфически и обратимо связываться только с белками и ферментами, имеющими сродство к данному лиганду. В аффинной хроматографии используют различные нерастворимые сорбенты. Так, все большее распространение получают поперечно-сшитые гранулы агарозы.

Иммуноадсорбция. Абсолютно специфическим адсорбентом для любого фермента или белка является антитело к этому белку, которое связано с нерастворимой матрицей. Антитела обладают высокой избирательностью только к тем белкам, против которых они были получены. Поэтому при использовании иммуноадсорбентов можно получить препараты фермента более чистые, чем при использовании на других типах аффинных адсорбентов.

Фронтально-вытеснительный вариант хроматографии. В этом случае используются значительные изменения коэффициентов распределения и эффективных коэффициентов диффузии целевого вещества при «малых» изменениях физико-химических свойств элюирующего раствора.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Этот вид хроматографии является важнейшим методом анализа и препаративного разделения биологически активных веществ. ВЭЖХ — это современная форма реализации классической хроматографии колоночного типа; она отличается возможностью выделять высокоочишенные вещества из сложной смеси, включающие в том числе и близкие по свойствам компоненты. При этом в рамках одного хроматографического эксперимента можно получить ряд высокоочи- шенных или индивидуальных компонентов.

К преимуществам ВЭЖХ относятся:

  • • высокая скорость процесса, позволяющая сократить продолжительность разделения от нескольких суток до минут;
  • • минимальная степень размывания хроматографических зон, что дает возможность разделять соединения, лишь незначительно различающиеся по константам сорбции;
  • • высокая степень механизации и автоматизации разделения и обработки информации, благодаря чему колоночная жидкостная хроматография достигла нового уровня воспроизводимости и точности.

К недостаткам метода ВЭЖХ, резко ограничивающим возможности его широкого использования, следует отнести дороговизну процессов, протекающих при повышенном давлении с использованием микрогранульных сорбентов, а следовательно, и высокой стоимости продуктов. Кроме того, основополагающие принципы ВЭЖХ затрудняют масштабирование процесса, что также ограничивает области применения ВЭЖХ.

Существуют различные варианты ВЭЖХ.

Нормшьно-фазовая хроматография. При данном варианте ВЭЖХ подвижная фаза менее полярна, чем неподвижная, и основной фактор, определяющий удерживание, — это взаимодействие сорбатов непосредственно с поверхностью либо с внутренним объемом сорбента.

Обращенно-фазовая хроматография. При этом варианте ВЭЖХ подвижная фаза более полярна, чем неподвижная, и удерживание определяется непосредственным контактом молекул сорбата с поверхностью или объемом сорбента: при этом ионизированные сорбаты не обмениваются на ионы подвижной фазы, сорбированные — на поверхности.

Ионообменная хроматография. При ионообменной хроматографии сорбция осуществляется путем обмена сорбированных ионов подвижной фазы на ионы хроматографируемых веществ. Аналогичным образом можно определить лигандообменную хроматографию.

Хроматография на динамически модифицированных сорбентах. Это вариант ВЭЖХ, при котором сорбат не взаимодействует непосредственно с поверхностью сорбента, а вступает в ассоциацию с молекулами поверхностных слоев элюента. Состав этих слоев, находящихся в динамическом равновесии с подвижной фазой, отличается от среднего для данного эксперимента состава подвижной фазы.

Ион-парная хроматография. Это такой вариант обращенно-фазовой хроматографии ионизированных соединений, при котором в подвижную фазу добавляется гидрофобный противоион, качественно изменяющий сорбционные характеристики системы.

Эксыюзионная хроматография. Это способ разделения соединений по их молекулярным массам, основанный на различии в скорости диффузии в порах неподвижной фазы молекул различных размеров.

Рассмотрим подробно наиболее распространенные виды ВЭЖХ.

В настоящее время из всех вариантов ВЭЖХ наиболее широко применяется обращенно-фазовая. Ее преимущество определяется методической простотой и универсальностью, во многих случаях — простотой механизма сорбции.

Термин обращенно-фазовая хроматография ввел А. Мартин в 1950 г. В отличие от других, ранее применявшихся систем распределительной хроматографии, здесь неподвижная фаза менее полярна, чем подвижная, что, собственно, и послужило поводом к такому названию.

Основными достижениями современной обращенно-фазовой ВЭЖХ как метода разделения белков является разработка неподвижных фаз с большим размером пор (больше 10 нм). Эти фазы обладают большой селективностью и обеспечивают большой выход продукта. Отличные хроматограммы получены на неподвижной фазе на основе силикагеля с порами размером 33 нм. На этих колонках были разделены такие высокомолекулярные белки, как коллаген, сывороточный альбумин, овальбумин, цепи фибриногена, молекулярная масса большинства соединений составляла от 40 до 300 kDa. Выход белкового компонента достигал 85%.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >