Меню
Главная
Авторизация/Регистрация
 
Главная arrow Медицина arrow ГЕНЕТИКА
Посмотреть оригинал

Определение нуклеотидных последовательностей (секвенирование)

Установление первичной структуры - нуклеотидной последовательности клонированного сегмента ДНК - необходимо для выяснения его структуры, функции и происхождения.

Имеется две категории методов секвенирования ДНК. В основе методов первой категории лежат химические реакции, в которых используют непосредственно фрагменты очищенной ДНК. Во втором случае используют ДНК-копии очищенных сегментов, полученные ферментативным путем. Эти подходы имеют некоторое сходство:

  • - фрагменты ДНК очищают с помощью клонирования;
  • - за один раз секвенируют только одну цепь ДНК, помеченную радиоактивным изотопом, и определяют ее нуклеотидную последовательность;
  • - образуется набор радиоактивно меченных одиночных цепей всех возможных длин - от 1 до п (и - полная длина секвенируемой молекулы).

Метод химического секвенирования основан на специфической модификации различных пуриновых и пиримидиновых оснований. Эти модифицированные основания выщепляются затем из полимеразной цепи с сохранением сахарофосфатного остова. Далее гидролизуют относительно нестабильные фосфодиэфирные связи, соседствующие с сайтом, где находилось удаленное модифицированное основание, в результате чего цепь разрывается (рис. 15.7).

На рис. 15.8 представлена схема химического метода секвенирования ДНК. Исходный фрагмент ДНК, меченный 32Р по 5'-концу, подвергается специфическому расщеплению по определенному нуклеотиду (например, А), в результате чего образуются радиоактивные фрагменты разной длины, которые разделяются по размерам при гель-электрофорезе, а радиоактивные из них выделяются с помощью радиоавтографии.

Схема получения семейства меченных по 5’-концу фрагментов ДНК в результате расщепления по определенному нуклеотиду (А)

Рис. 15.8. Схема получения семейства меченных по 5’-концу фрагментов ДНК в результате расщепления по определенному нуклеотиду (А)

Энзиматический метод секвенирования основан на энзиматическом введении нуклеотида, терминирующего полинуклеотидную цепь (рис. 15.9). В этом случае обычно используют дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты, в которых дезоксирибоза-З'-ОН, представленная в нормальных нуклеотидах, отсутствует. Такой модифицированный нуклеотид, внедряясь в цепь ДНК с помощью ДНК-полимеразы, блокирует присоединение следующего нуклеотида. Синтез in vitro молекулы ДНК в присутствии затравки (праймера) и небольшого количества одного из таких модифицированных нуклеотидов приводит к образованию фрагментов ДНК в виде «лесенки». Если для получения таких фрагментов применять меченую ДНК (обычно проводят четыре реакции синтеза с использованием различных нуклеотидов, терминирующих цепь), а электрофоретический анализ проводить на четырех дорожках геля, то можно определить последовательность нуклеотидов.

В настоящее время используют модифицированный метод, сводящийся к флуоресцентному анализу наборов фрагментов ДНК в процессе движения по одной дорожке геля.

Схема энзиматического метода секвенирования нуклеиновых кислот, основанного на энзиматическом введении нуклеотида, терминирующего цепь

Рис. 15.9. Схема энзиматического метода секвенирования нуклеиновых кислот, основанного на энзиматическом введении нуклеотида, терминирующего цепь: а - синтез in vitro в присутствии затравки с образованием «лесенки» фрагментов; б - инкубация четырех различно окрашенных флуоресцирующих затравок в смеси нуклеотидов с добавлением различных дидНТФ, прекращающих рост цепи (А, Т, Ц, Г)

Работа по определению нуклеотидных последовательностей крупных геномов, состоящих из миллионов и более нуклеотидов, значительно облегчается, поскольку существуют компьютерные программы, с помощью которых можно быстро найти перекрывающиеся последовательности в анализируемых фрагментах, а затем составить полную карту генома.

 
Посмотреть оригинал
Если Вы заметили ошибку в тексте выделите слово и нажмите Shift + Enter
< Предыдущая   СОДЕРЖАНИЕ   Следующая >
 

Популярные страницы