Методы определения микотоксинов

Анализ индивидуальных микотоксинов и их метаболитов сложен, поскольку известны более ста таких веществ и вероятно, что лишь один токсин присутствует в крайне малом количестве в образце, характеризующемся весьма сложной органической матрицей.

Содержание большинства микотоксинов исследуется с помощью тонкослойной хроматографии. Однако более высокая разделительная способность и меньшие затраты на анализ, типичные для высокоэффективной жидкостной хроматографии, делают именно этот метод более популярным. Необходимые уровни обнаружения составляют несколько мкг/кг и могут быть достигнуты благодаря использованию подходящего метода концентрирования образца и чувствительности детектора.

В 1999 г. опубликована первая российская стандартная методика МУК 4.1.787 «Определение массовой концентрации микотоксинов в продовольственном сырье и продуктах питания. Подготовка проб методом твердофазной экстракции», основанная на комбинации твердофазной экстракции и ВЭЖХ, утвержденная Минздравом России.

Пробоподготовка

Процесс пробоподготовки, как правило, является наиболее трудоемкой и сложной стадией анализа реальных образцов для большинства химико-аналитических лабораторий. Неудачный выбор методов подготовки и очистки пробы может привести к неверным результатам.

Последовательность действий при подготовке пробы для определения микотоксинов следующая: 1) проведение экстракции образцов; 2) отделение исследуемого компонента от мешающих примесей; 3) концентрирование образца.

Экстракция объекта исследования, предусматривающая получение единого экстракта, содержащего все микотоксины, осуществляется смесью вода : ацетонитрил (16 : 84).

Отделение интересующего компонента от примесей проводят методом твердофазной хроматографии, включающим предварительную очистку, концентрирование и окончательную очистку на концентрирующих патронах Диапак.

Метод твердофазной экстракции (ТФЭ) — простой и эффективный метод, основанный на выделении интересующих компонентов (или мешающих его определению компонентов матрицы) путем сорбции их на твердом носителе (сорбенте), находящемся в небольшом патроне. Метод твердофазной экстракции подобен колоночной хроматографии.

Различают два основных способа тведофазной экстракции: удерживающая и неудерживающая ТФЭ. При проведении удерживающей ТФЭ целевой компонент и некоторые мешающие компоненты образца удерживаются на сорбенте при прохождении образца через колонку (картридж, патрон для ТФЭ). Примеси, взаимодействующие с сорбентом, удаляются при пропускании через картридж слабого элюента. Затем с помощью сильного элю- ента, добавляемого малыми порциями, исследуемое вещество также элюируется с сорбента. Очищенное, сконцентрированное вещество теперь готово для проведения количественного анализа методом ВЭЖХ или другим аналитическим методом. При неудерживающей ТФЭ на сорбенте сразу оседают мешающие примеси, а целевой компонент проходит через колонку, не удерживаясь. Таким образом, достигается его очистка от мешающих примесей. Полученный элюат затем можно сконцентрировать при помощи упаривания или отдувки растворителя и исследовать любыми доступными аналитическими методами.

Характерная особенность ТФЭ по сравнению с жидкостной экстракцией состоит в том, что первый метод обладает более широкими возможностями, позволяющими варьировать природу и силу взаимодействия образца с сорбентом и элюентом. Благодаря расширению диапазона специфических взаимодействий, повышающих селективность разделения, ТФЭ в большей степени обеспечивает количественное выделение, тонкую чистку, концентрирование и выделение каждого из определяемых соединений или их отделение от мешающих компонентов.

В тех случаях, когда матрица представляет собой многокомпонентную систему, требующую более детального исследования, ТФЭ позволяет проводить фракционирование пробы. На последовательно соединенных патронах можно одновременно разделять и выделять различные классы соединений: органические и неорганические, высоко- и низкомолекулярные, неполярные, ионогенные и т. д. Значительное сокращение числа операций, объема растворителей и количества вспомогательного оборудования уменьшает продолжительность пробоподготовки, снижает ее стоимость и приходящиеся на нее трудозатраты, а также повышает точность последующего анализа.

Конструкция концентрирующих патронов Диапак представлена на рис. 5. Корпуса патронов изготовлены из полипропилена и выпускаются в двух конструктивных модификациях: Тип-1 и Тип-2. Патроны герметично закрыты крышкой сверху и заглушкой снизу.

Устройство патронов Диапак

Рис. 5. Устройство патронов Диапак: а — Тип-1; б — Тип-2;

1 — заглушка, 2 — фильтр, 3 — сорбент

Патроны Диапак модификации Тип-1 представляют собой разъемные капсулы из химически стойкого полимера. Фиксация сорбента в патроне осуществляется с помощью двух фильтрующих дисков из пористого полимера. Масса сорбента в патроне объемом 1 см3 составляет 0,6 г.

Концентрирующие патроны этого типа имеют две взаимозаменяемые заглушки, которые предотвращают попадание в патрон загрязнений и предохраняют сконцентрированный образец от внешних воздействий. Цвет заглушек служит для маркировки патронов. Входной и выходной патрубки патрона соответствуют разъемам типа «Луер», что позволяет последовательно соединять несколько патронов. Нанесение пробы на патрон и ее элюирование может осуществляться либо с помощью шприца с разъемом типа «Луер», либо под действием гидростатического перепада (самотеком), а иногда — с помощью перистальтического или вакуумного насоса.

Патроны Диапак модификации Тип-2 представляют собой неразъемный пластиковый корпус переменного сечения, узкая часть которого служит для размещения сорбента, а широкая, объемом около 10 см3, предназначена для размещения как сорбента (при необходимости), так и элюента. В нижней части пластикового корпуса, под сорбентом, помещен малый пористый фильтр; над столбом сорбента может быть плотно укреплен (благодаря незначительной конусности корпуса патрона) большой пористый фильтр. Патрон модификации Тип-2 герметично закрывается верхней крышкой, а также нижней заглушкой от патрона Тип-1. Верхняя крышка предохраняет патрон от пыли и позволяет перемешивать суспензию сорбента в растворителе. Прокачивание пробы и элюента через патрон достигается с помощью водоструйного насоса. К числу примечательных особенностей патронов данного типа относятся больший объем сорбента (3-6 см3), легкость нанесения пробы и введения элюента, а также удобство подсоединения выходного патрубка к вакуумному устройству посредством резиновой пробки с отверстием (рис. 5).

В большинстве случаев для заполнения патронов используются сорбенты на основе силикагеля с химически привитыми функциональными группами. Вместе с тем по-прежнему находят широкое применение полярные адсорбенты — силикагель и оксид алюминия.

Одним из важнейших достоинств сорбентов на основе силикагеля является высокая интенсивность сорбции и десорбции, позволяющая работать при достаточно высоких скоростях нанесения анализируемой пробы на патрон и ее элюирования с патрона, что существенно ускоряет процедуру пробоподготовки. Другим преимуществом указанных сорбентов является постоянство их объема при контакте с органическими и водно-солевыми растворами. Сорбенты на основе силикагеля не требуют длительного предварительного набухания и после проведения кратковременной активации, кондиционирования или регенерации пригодны к работе. 176

Третья особенность привитых сорбентов — их достаточно высокая химическая стабильность, хотя по этому показателю они все же уступают полимерным сорбентам. Эта стабильность обусловлена относительной кратковременностью контакта растворителей, используемых для концентрирования и очистки, с поверхностью сорбента, что напрямую связано с дискретным характером протекания ТФЭ по схеме «посадка — смыв». Например, гидролитическая стабильность обращенно-фазовых сорбентов, применяемых в ТФЭ, гарантируется в диапазоне pH 1-10, т. е. значительно более широком, чем это принято для ВЭЖХ-сорбентов с той же химической природой поверхности. Для одноразовых (нерегенерируе- мых) патронов этот диапазон еще шире.

Необходимо помнить, что сорбционная емкость сорбентов на основе химически модифицированных силикагелей заметно ниже, чем у их аналогов на основе органических полимеров. Для стандартного патрона объемом 1 см3 сорбционная емкость по большинству органических и неорганических веществ обычно находится в пределах 5-20 мг/патрон. Такая емкость вполне достаточна для концентрирования микропримесей. Чтобы с большей точностью установить нагрузку, необходимо предварительно определить емкость патрона «до проскока» интересующего компонента. При этом следует учитывать и возможность перегрузки патрона, причина которой может быть обусловлена перегрузкой не столько по целевому компоненту, сколько по матричным примесям, из-за чего нередко механизм разделения меняется с элюентного проявления на фронтальное вытеснение.

В ТФЭ используются три основных режима разделения: обращенно-фазовый (ОФ), нормально-фазовый (НФ), ионный обмен (ИО).

В табл. 22 представлен перечень патронов Диапак с краткой характеристикой сорбентов и указанием основных областей применения.

Характеристика сорбентов, используемых в патронах Диапак

Таблица 22

Название патрона

Краткая характеристика сорбента

Основные

области

применения

Диапак Силикагель (С)

Гидрофильный слабокислотный сорбент (С — с постоянной активностью)

Адсорбционная ТФЭ органических соединений

Диапак А (АУ)

Гидрофильный слабощелочной сорбент на основе А1203 (АУ — с добавлением 10 % активированного угля)

Адсорбционная ТФЭ органических соединений

Диапак С1 Диапак С1 Plus Диапак С8 Диапак С8 Plus Диапак Cl6 (С 16М) Диапак С16 Plus

Гидрофобные сорбенты с привитыми метальными (С 1), октальными (С8) и гексадецильными (С 16) группами с увеличивающейся ги- дрофобностью (Plus — меньший размер частиц и диаметр пор)

ОФ ТФЭ органических соединений

Диапак Фенил Диапак Фенил Plus

Гидрофобный сорбент с привитыми фенильными группами

ОФ ТФЭ органических соединений

Диапак Нитрил (Н) Диапак Нитрил Plus

Слабогидрофобный сорбент с привитыми нитрильными группами

ОФ и НФ ТФЭ

органических

соединений

Диапак Диол Диапак Диол Plus

Гидрофильный нейтральный сорбент с привитыми диольными группами

НФ ТФЭ органических соединений и Э КС клюз и- онная ТФЭ высокомолекулярных соединений

Диапак Амин Диапак Амин-М Диапак Амин Plus

Слабоосновный анионообменник с привитыми аминогруппами (М — с меньшим диаметром пор)

НФ и анионообменная ТФЭ органических соединений

Диапак ДАЕД

Слабоосновный анионообменник с привитыми третичными аминогруппами

Анионообменная ТФЭ органических соединений

Окончание табл. 22

Название патрона

Краткая характеристика сорбента

Основные

области

применения

Диапак ТА

Сильноосновный анионообменник с привитыми четвертичными аммониевыми группами

Анионообменная ТФЭ органических и неорганических соединений

Диапак Карбокси

Слабокислотный карбоксильный катионообмснник

Катионообменная ТФЭ органических соединений

Диапак Сульфо

Сильнокислотный катионообмен- ник с привитыми сульфогруппами

Катионообменная ТФЭ органических соединений и ионов металлов

Диапак ИДК

Комплексообразующий сорбент с привитой иминодиуксусной кислотой

ИО ТФЭ ионов тяжелых металлов на основе комплексообра- зования

Диапак П (Г1-3)

Гидрофобный сорбент на основе сверхсшитого полистирола

ОФ ТФЭ органических соединений

Разработка методики очистки (концентрирования) образцов и выбор соответствующего патрона в значительной степени связаны со свойствами определяемого вещества, свойствами раствора матрицы и методом последующего анализа. В общем случае очистка экстракта протекает по одному из трех вариантов:

  • 1) определяемые компоненты не сорбируются, а мешающие компоненты удерживаются в патроне;
  • 2) определяемые компоненты сорбируются и концентрируются, а вещества, загрязняющие пробу, проходят через патрон;
  • 3) определяемые и мешающие компоненты удерживаются и концентрируются в патроне, но могут быть фракционированы путем ступенчатого или непрерывного градиентного элюирования (градиент pH, ионной силы или элюирующей силы растворителя).

Как указывалось выше, ТФЭ имеет много общего с колоночной и тонкослойной хроматографией, поэтому основные закономерности, характерные для хроматографических методов разделения, полностью применимы и к ТФЭ.

В общем случае при использовании патронов для ТФЭ выполняются следующие операции:

  • 1. Активация — приведение патрона в рабочее состояние. Подготовка патронов проводится непосредственно перед анализом и занимает не более 3 мин. Для НФ ТФЭ патроны промывают неполярным растворителем или смесью растворителей, как правило, хорошо обезвоженных; для ОФ ТФЭ промывка патронов осуществляется смесью полярных или малополярных (в отдельных случаях неполярных) растворителей; для ИО ТФЭ — буферными растворами или растворами электролитов, переводящими патроны в ту или иную ионную форму.
  • 2. Кондиционирование (уравновешивание) — промывка патрона растворителем (или смесью растворителей), который использовался для растворения матрицы. При этом также происходит удаление избытка активирующих агентов.
  • 3. Нанесение образца — загрузка подлежащего очистке или концентрированию образца на патрон.
  • 4. Продувка (обычно сухим азотом) или промывка слабым растворителем для удаления остатков раствора матрицы или предварительной очистки сконцентрированного образца.
  • 5. Элюирование — смыв сконцентированной или очищенной пробы с патрона.

Афлатоксин М, извлекают из пробы жидкого молока пропусканием ее через патрон Диапак С16М. Затем фракцию, содержащую афлатоксин М,, элюируют хлороформом с патрона и, после высушивания и упаривания, проводят окончательную очистку на патроне Диапак С. Афлатоксин Mi элюируют с патрона смесью ацетон — хлороформ или метанол — хлороформ. Элюат выпаривают досуха и перерастворяют сухой остаток в смеси вода — ацетонитрил. Проба готова к хроматорганическому анализу.

Афлатоксин М[ из кисломолочных напитков и сметаны экстрагируют хлороформом в присутствии хлорида натрия и лимонной кислоты и, после высушивания и упаривания, проводят окончательную очистку на патроне Диапак С.

Микотоксин патулин извлекают из осветленных соков и напитков пропусканием через патрон Диапак П-3. Затем патулин элюируют этилацетатом с патрона и после обработки раствором карбоната натрия, высушивания, упаривания и перерастворения проводят окончательную очистку на патроне Диапак С. Патулин элюируют с патрона раствором этилацетата в бензоле. После упаривания сухой остаток перерастворяют в хлороформе для дальнейшего определения микотоксина методом ТСХ или в бидистилли- рованой воде при определении методом ВЭЖХ.

Соки и напитки с мякотью и консистентные продукты разводят водой, осветляют растворами Карреза (I — K4[Fe(CN)6]; II — (CH3COO)2Zn) в соответствии с ГОСТ 28038 «Продукты переработки плодов и овощей. Метод определения микотоксина патулина», фильтруют и экстрагируют патулин пропусканием фильтрата через патрон Диапак П-3. Затем патулин элюируют этилацетатом с патрона и после обработки раствором Na2C03, высушивания, упаривания и перерастворения проводят окончательную очистку на патроне Диапак С. Пробы готовы к хроматографическому анализу.

При определении афлатоксина В, и зеараленона проводят очистку водно-ацетонитрильного экстракта на патроне Диапак А-3, из элюата концентрируют микотоксины на патроне Диапак П-3, целевую фракцию элюируют последовательно ацетонитрилом и бензолом в ацетонитриле, высушивают от остатков воды и после упаривания и перерастворния в бензоле проводят окончательную очистку на патроне Диапак Н (Диапак С — в случае анализа кукурузы и продуктов из нее). Зеараленон элюируют с патрона Диапак Н уксусной кислотой в бензоле, упаривают досуха и сухой остаток перерастворяют в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению. Затем элюируют афлатоксин В, ацетонитрилом в бензоле с патрона, упаривают досуха и сухой остаток также растворяют в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению. Таким образом, фракционным элюированием получают две фракции, содержащие афлатоксин В, и зеараленон, готовые к хроматографическому анализу.

При определении дезоксиваленола и Т-2 токсина проводят предварительную очистку водно-ацетонитрильного экстракта на патроне Диапак АУ-3 и элюат концентрируют упариванием досуха. После перерастворения в хлороформе проводят окончательную очистку на патроне Диапак Н. Для хроматографического анализа две фракции, содержащие дезоксиваленол и Т-2 токсин, получают фракционным элюированием. Т-2 токсин не удерживается на данном патроне, поэтому фракцию, содержащую микотоксин, собирают, упаривают досуха и перерастворяют в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению Т-2 токсина. Дезоксиваленол элюируют с патрона ацетоном в хлороформе, элюат выпаривают досуха и также растворяют в подходящем растворителе.

Определение

Метод ВЭЖХ пригоден для анализа содержания микотоксинов в орехах, пряностях, корме для животных, муке, инжире и продуктах из яблок. Разделение производится на колонке с обращенной фазой, а для регистрации используются детектор с диодной матрицей, флуориметрический детектор, а также амперометрический детектор. Идентификация проводится по времени удерживания и по спектральным данным.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >