Лабораторная работа № 14. Высев суспензионной культуры на твердую агаризованную среду

Культивирование отдельных (одиночных) клеток позволяет получать микроколонии и исследовать генетическую и физиологическую стабильность или изменчивость этого материала. Одиночные клетки используют в клеточной селекции мутантных, гибридных и трансформированных линий. В эти клетки можно ввести новые гены, в то же время это хорошая модель для изучения ее онтогенеза и физиологии. Источником отдельных (одиночных) клеток являются клеточные суспензии, растущие на жидкой питательной среде. Для получения микроколоний каллусной ткани используется метод плейтинга — смешивание суспензии клеток с агаризованной питательной средой в равных пропорциях.

Цель работы: получить микроколонии каллусной ткани из суспензионных клеток.

Оборудование и материалы: стерильные чашки Петри; чашки Петри с агаризованной средой; стерильные препаровальные иглы, цилиндр, пинцеты; флаконы с 96 %-м спиртом; спиртовка.

Объект исследования: суспензионная культура.

Ход работы.

Клеточную суспензию перелить в стерильный цилиндр и оставить на 5 мин. Пипеткой отобрать 5 мл верхней фракции суспензии (в верхнем слое суспензии преобладает фракция одиночных клеток) и смешать с 5 мл агаризованной (1,4 % агара) среды для культивирования каллуса. Работу проводить в стерильной посуде: мерном цилиндре, стакане. Полученную смесь разлить в стерильные чашки Петри слоем до 1 см. Чашки Петри закрыть крышками и герметизировать парафил- мом. Рассчитать количество высеянных клеток. Количество колоний подсчитать через три — шесть недель.

Задание. Результаты зарисовать, подсчитать количество выросших колоний в каждой чашке Петри.

Определить эффективность высева:

где ЭВ — эффективность высева.

Лабораторная работа № 15. Индукция органогенеза в каллусной ткани картофеля

Фитогормоны — это биологические регуляторы роста и развития растений, осуществляющие взаимодействие клеток, тканей и органов, стимулирующие и ингибирующие морфогенетические и физиологические процессы в растительных организмах. Фитогормоны влияют на деление и рост клеток растяжением, состояние покоя, созревание, старение, формирование пола, устойчивость к стрессу, тропизмы, транспирацию; обеспечивают функциональную целостность растительного организма, закономерную последовательность фаз индивидуального развития.

Ауксины в культуре тканей вызывают рост клеток растяжением и деление, в сочетании с цитокининами — органогенез. В биотехнологии применяют как природные ауксины (ИУК), так и синтетические — ИМК (индолил-3-масляная кислота), 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота), НУК (нафтилуксусная кислота).

Цитокинины в сочетании с ауксинами индуцируют митозы, пролиферацию клеток, почек и побегов. К природным цитокининам относятся: зеатин, кинетин (6-фурфуриламинопурин); к синтетическим — БАП (6-бензиламинопурин).

Следовательно, изменяя соотношение гормонов в питательных средах, можно в какой-то степени изменять и генетические программы клеток и тканей. Эти процессы известны как дифференциация клеток и тканей, дедифференциация и редифференциация.

В 1955 г. Скуг и Миллер предложили гипотезу гормональной регуляции в культуре клеток и тканей, которая сейчас известна как правило Скуга — Миллера: если концентрации ауксинов и цитокининов в питательной среде относительно равны или концентрация ауксинов незначительно превосходит концентрацию цитокининов, то образуется каллус; если концентрация ауксинов значительно превосходит концентрацию цитокининов, то формируются корни; если концентрация ауксинов значительно меньше концентрации цитокининов, то образуются почки, побеги.

Таким образом, для индукции органогенеза каллусы пересаживают на среду с высоким содержанием цитокининов, а для укоренения образовавшихся побегов используют среду с повышенным содержанием ауксинов.

Индукция морфогенеза и регенерация растений — сложный многостадийный процесс. У каллусной культуры картофеля можно выделить несколько стадий: индукцию зеленых меристематических зон; появление почек de novo; формирование микропобегов с последующим их укоренением.

Цель работы: провести индукцию органогенеза в каллусной ткани картофеля.

Оборудование и материалы: ламинар-бокс; колбы емкостью 50 мл со стерильной питательной средой (МС без гормонов); колбы со средами для органогенеза и ризогенеза; стерильные препаровальные иглы, пинцеты; флаконы с 96 %-м спиртом; спиртовка.

Объект исследования: пробирки с каллусами картофеля.

Ход работы.

Стерильным пинцетом переложить каллусы на стерильную поверхность, разделить на кусочки 5x5 мм и поместить в колбы с питательными средами: а) МС без гормонов; б) МС + 2 мг/л 6-БАП + + 1 мг/л НУК. Колбы перенести в культуральную комнату с температурой 25 °С, влажностью воздуха 70 % и интенсивностью освещения 3 Клк.

Через одну неделю отметить появление структурированных очагов, через три — пять недель — меристематических зон ярко-зеленого цвета. Еще через одну-две недели отметить появление апексов.

При дальнейшем культивировании апексы превращаются в микропобеги.

На одном экспланте может дифференцироваться до нескольких десятков побегов. Когда они достигнут высоты 10 мм, отделить их от каллусной ткани в стерильных условиях. Перенести побеги на питательные среды для индукции корнеобразования: а) МС без гормонов; б) МС + 2 мг/л ИМК + 1 мг/л ГК. Поместить на 20 дней в темноту. Через 7—14 дней отметить появление корней.

Задание. Записать количество апексов, появившихся на каждом каллусе. Результаты эксперимента зарисовать через две, четыре, шесть и восемь недель. Сделать выводы о влиянии различных гормонов на органогенез каллусной ткани.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >