ТЕХНИКА ВВЕДЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Методы исследований

Необходимым условием работы с культурой изолированных тканей является соблюдение строгой стерильности. Богатая питательная среда является прекрасным субстратом для развития в ней микроорганизмов, а изолированные от растения фрагменты (экспланты), которые помещают на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами, поэтому нужно стерилизовать как эксплант, так и питательную среду. Все манипуляции с изолированными тканями (введение в культуру, пересадка на свежую питательную среду) проводят в асептическом помещении (ламинар-бок- се) стерильными инструментами. Важно соблюдать стерильность и во время культивирования изолированных тканей, особенно при перепаде температуры и влажности, так как при этом пробки становятся влажными и по ним в пробирку могут проникать микроорганизмы.

Стерилизацию эксплантов и семян проводят, выдерживая их 5—20 мин в стерилизующих растворах с последующей многократной промывкой их стерильной водой. Продолжительность процесса зависит от характера экспланта и от стерилизующей активности раствора. Семена стерилизуют 10—20 мин, а вегетативные части — 5—10 мин (табл. 1.1)[1]. Органы растений, из которых изолируют эксплант для введения в культуру, предварительно моют щеткой в мыльном растворе и споласкивают дистиллированной водой, а затем погружают на несколько секунд в 70%-ный этанол. Семена погружают в спирт на 1—2 мин. Кроме собственно стерилизующего действия спирта обработка тканей этанолом перед помещением в основной раствор повышает стерилизующий эффект последнего.

Стерилизация исходного растительного материала

Объект

Время стерилизации

диацид,

0,1%-ный

раствор

сулема,

0,1%-ный

раствор

гипохлориты (Na, Са),

5—9%-ный раствор

пероксид водорода, 10—12%-ный раствор

Семена сухие

15—20

10—15

15—20

12—15

Семена набухшие

6—10

6—8

10—15

6—8

Ткани мясистого корня, клубня

20—30

15—25

15—20

Одревесневшие

стебли

20—40

20—25

20—25

Листья

1—3

1—3

3—6

3—5

Апексы

1—10

1—7

3—15

2—7

Для стерилизации семян, верхушечных меристем, кусочков ткани, выделенных из различных частей растения, применяют следующие растворы: 0,1%-ный — сулемы (двухлористая ртуть), 0,1%-ный — диацида, 13—20%-ный — пероксида водорода, 10%- ный — хлорамина, 8%-ный — гипохлорита натрия или кальция.

Диацид готовят, растворяя отдельно 330 мг этанолмеркурхлори- да и 660 мг цетилпиридиния хлорида в горячей воде (около 300 мл), затем их смешивают и доводят объем жидкости до 1 л, добавляют несколько капель детергента твин-80; хранят в плотно закрытой колбе в темноте. Перед стерилизацией ткань растения предварительно очищают. Корнеплоды, клубни, толстые стебли растений тщательно моют щеткой с мылом в теплой проточной воде, снимают кожуру (у корней и корнеплодов), кроющие чешуи (у листьев), промывают дистиллированной водой и опускают на несколько секунд (семена — на 1—2 мин) в 70%-ный этиловый спирт. Обработка тканей этанолом повышает эффект основного стерилизующего раствора. Затем растительные объекты многократно прополаскивают в стерильной воде.

Пероксид водорода рекомендуется использовать для фасоли, люпина, подсолнечника (с очищенной кожурой), сулему — для томатов, тыквы и др. Продолжительность стерилизации семян сулемой — 10—15 мин, пероксидом водорода — 30 мин, для меристем и кусочков тканей требуется примерно в 2 раза меньше времени. Опушенные семена (хлопчатник) обрабатывают концентрированной серной кислотой в течение 5 мин. Легче всего семена отмываются от пероксида водорода. После сулемы и диацида воду меняют 5—6 раз.

Семена томатов, яблони, тыквы, бобов и табака ко времени созревания заключены в мясистые, деревянистые или костянковидные покровы. Поэтому здоровые, с неповрежденной поверхностью плоды этих культур достаточно тщательно промыть мыльной водой, затем — несколько раз спиртом, после чего в строго асептических условиях их разрезают. Стерильным пинцетом вынимают семена и помещают их в стерильные чашки Петри для проращивания.

Поверхностная стерилизация освобождает эксплант только от наружной инфекции. Если же ткани экспланта имеют внутреннюю инфекцию, то его необходимо обработать антибиотиками. Особенно богаты внутренней инфекцией ткани тропических и субтропических растений с крупными сосудами. Загрязнение культур грибами или бактериями обычно выявляется через 3—14 суток после посадки. Загрязненные культуры необходимо тотчас же удалить, чтобы избежать заражения воздуха в световой комнате.

Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С и давлении 0,7—1 атм в течение 20 мин. Если в состав питательной среды входят вещества, разрушающиеся при высокой температуре, то их подвергают холодной стерилизации, пропуская через бактериальные фильтры с диаметром пор 0,22—0,45 мкм, после чего добавляют в проавтоклавированную охлажденную до 40 °С основную среду.

Посуду, предварительно завернутую в фольгу или оберточную бумагу, стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при 160 °С в течение 2 ч.

Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям макроэлементы (азот, фосфор, калий, кальций, магний, серу, железо) и микроэлементы (бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.), а также витамины, углеводы, фитогормоны или их синтетические аналоги. Некоторые питательные среды содержат гидролизат казеина, аминокислоты. Кроме того, в состав питательных сред входит этиленди- аминтетрауксусная кислота (ЭДТА) или ее натриевая соль, которые улучшают доступность железа для клеток.

Для получения каллусной ткани в отдельных случаях к питательной среде добавляют жидкий эндосперм кокосового ореха (кокосовое молоко), каштана и др.

Углеводы являются необходимым компонентом питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей, так как в большинстве случаев последние не способны к автотрофному питанию. Чаще всего в качестве углевода используют сахарозу или глюкозу в концентрации 2—3 %.

Фитогормоны необходимы для дедифференцировки клеток и для индукции клеточных делений. Поэтому для получения каллусных тканей в состав питательных сред должны обязательно входить ауксины, вызывающие клеточную дедифференцировку, и цитокини- ны, индуцирующие деление клеток. В случае индукции стеблевого морфогенеза содержание ауксинов в среде может быть снижено или они могут быть полностью исключены из питательной среды.

В качестве источников ауксинов в питательных средах используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), индолил-3- уксусную кислоту (ИУК), а-нафтилуксусную кислоту (НУК), индо- лилмасляную кислоту (ИМК).

В качестве источников цитокининов в искусственных питательных средах используют кинетин, 6-бензиламинопурин (БАП), зеа- тин, 2-изопентениладенин (2iP). 6-БАП и зеатин проявляют более высокую активность в поддержании роста изолированных тканей и индукции органогенеза по сравнению с кинетином. В состав некоторых сред входит аденин и другие биологически активные вещества.

В настоящее время известно большое число различных по составу питательных сред, но наиболее часто применяемая при выращивании изолированных растительных тканей в условиях in vitro среда Т. Мурасига и Ф. Скуга, впервые составленная в 1962 г. Эта среда содержит хорошо сбалансированный состав питательных веществ и отличается от других, как правило, соотношением аммонийного и нитратного азота (табл. 1.2).

Таблица 1.2

Состав питательных сред для культивирования изолированных тканей растений

Компоненты

питательной

среды

Концентрация, мг/л

Мурасига — Скуга

Гам-

борга

Шенка — Хиль- дебрандта

Гресхофф — Доу

Нича

nh4no3

1650

2500

2500

720

nh4h2po4

300

kno3

1900

1000

950

СаС12-2Н20

440

150

200

150

166

MgS04-7H20

370

250

400

250

185

(NH4)2S04

130

200

KH2P04

170

68

2ЭДТА

37,3

37,3

20,0

37,3

37,3

FeS04-7H20

27,95

27,85

15,0

27,8

27,8

NaH2P04-H20

150

90

H3BO3

6,2

3,0

5,0

3,0

10

MnS04-4H20

22,3

10,0

10,0

10,0

25

Компоненты

питательной

среды

Концентрация, мг/л

Мура- сига — Скуга

Гам-

борга

Шенка — Хиль- дебрандта

Гресхофф — Доу

Нича

ZnS04-7H20

8,6

2,0

1,0

3,0

10

KI

0,83

0,75

1,0

0,75

Na2Mo04-2H20

0,25

0,25

0,1

0,25

0,25

CuS04-5H20

0,025

0,025

0,2

0,25

0,025

СоС12-6Н20

0,025

0,025

0,1

0,25

Глицин

2,0

2,0

Мезоинозит

100

100

1000

10

200

Никотиновая

кислота

0,5

1,0

5,0

1,0

Пиридок- син — НС1

0,5

1,0

0,5

0,1

1

Тиамин — НС1

1

10,0

5,0

0,1

3

2,4-Д

  • 0,1-
  • 1,0

Кинетин

0,1

0,1

Глутамин

2,0

Сахароза

30 000

30 000

30 000

20 000

60 000

Для приготовления твердых питательных сред используют агар- агар, который представляет собой полисахарид, получаемый из морских водорослей. Применять желатин в качестве затвердителя питательных сред для культивирования клеток растений запрещено.

С целью рационального использования времени растворы солей макро- и микроэлементов, а также витаминов и фитогормонов готовят более концентрированными, что позволяет использовать их многократно. Концентрированные (маточные) растворы хранят в холодильнике.

Ламинар-боксы предназначены для культивирования изолированных клеток, тканей и некоторых других работ, требующих стерильности, которая обеспечивается с помощью бактериальных воздушных фильтров (рис. 1.7, а). За 10—20 мин до начала работы ламинар-бокс облучают бактерицидными ультрафиолетовыми лампами. Предварительно в ламинаре размещают спиртовую горелку, спички, фарфоровый стакан с 96%-ным спиртом и стерильной водой, а при изолировании меристем — и бинокулярную лупу. Внутреннюю поверхность ламинар-бокса, лупу, спиртовку, пробирки или колбы с питательной средой протирают 70%-ным спиртом.

Условия культивирования изолированных клеток и тканей растений.

Для успешного культивирования изолированных клеток и тканей растений необходимо соблюдать определенные условия выращивания. Большинство каллусных тканей не нуждается в свете, так как не имеют хлоропластов и питаются гетеротрофно. Исключение составляют некоторые зеленые кал- лусные ткани, такие как каллусная ткань мандрагоры. В некоторых случаях каллусные ткани, не способные к автотрофному питанию, все же выращивают на непрерывном освещении, что является необходимым условием дальнейшего успешного морфогенеза, как у люцерны. Большинство же каллусных тканей получают в темноте или при рассеянном свете.

Детерминированные к морфогенезу ткани переносят на свет и далее культивируют их при освещенности 1000—4000 лк.

Культивирование изолированных меристем и их микроразмножение также происходит на свету. Освещенность климатической камеры или световой комнаты должна составлять в зависимости от культуры 3000—10 000 лк (рис. 1.7, б). Необходимо учитывать фотопериод, который требуется для данного культивируемого объекта. Влажность в культуральной комнате должна составлять 60— 70 %. Более сухой воздух способствует усыханию питательной среды в пробирках и колбах, если они закрыты ватными пробками, изменению концентрации, входящих в ее состав компонентов и нарушению условий культивирования. Для повышения влажности в комнате можно использовать поддоны с водой.

Оптимальная температура для большинства культивируемых тканей — 22—25 °С, для культуры тканей тропических растений она может достигать 29—30 °С. В случае индукции морфогенеза температуру понижают до 18—20 °С.

Наилучшие световой и температурный режимы, а также режим оптимальной влажности можно создать с помощью климатических камер (рис. 1.7, в).

Ламинар-бокс (а); световая комната (б); климакамера (в)

Рис. 1.7. Ламинар-бокс (а); световая комната (б); климакамера (в)

  • [1] Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологиина их основе : учеб, пособие. М. : ФБК-ПРЕСС, 1999.
 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >