Ситуационные задачи

  • 1. Назовите факторы, оказывающие влияние на формирование каллусной ткани рыхлого типа, средней плотности и плотного типа. Возможно ли из одного типа плотности каллусной ткани перевести ее в другой?
  • 2. Для подсчета жизнеспособности, степени агрегированности и плотности суспензионной культуры используют камеру Фукса — Розенталя. Рассчитайте плотность суспензионной культуры, если известно, что в первой повторности число клеток в камере составило 125 шт., во второй — 128 шт. и в третьей — 130 шт. Разведение суспензии составляет 10, 15, 18.
  • 3. Рассчитайте прирост суспензионной культуры по объему, массе и с использованием камеры Фукса — Розенталя. Какой из этих способов, по вашему мнению, является более эффективным и точным?
  • 4. Известно, что масса каллусной ткани картофеля в количестве 12 шт. после трех пассажей составляет 3483 мг. Рассчитайте средний прирост одного каллуса, если в начале третьего пассажа масса каллусов составляла 671 мг.
  • 5. Известно, что объем клеток суспензионной культуры моркови в начале пассажа составляет 8,3 мл3, а в конце пассажа — 19,1 мл3. Рассчитайте средний прирост суспензионной культуры и определите конечный объем клеток в конце четвертого пассажа.
  • 6. Рассчитайте интенсивность роста каллусной ткани через 5 недель с начала культивирования, если в начале пассажа вес каллуса составил 112 мг, а в конце пассажа он увеличился в 2,7 раза.
  • 7. Для чего в биотехнологии используют ферментеры? В чем разница между стационарным, проточным и полупроточным ферментером?

Лабораторный практикум

Работа 1. Получение каллусной ткани из листьев табака

Объяснение. Табак является модельным объектом в биотехнологии растений. Это связано с тем, что клетки растений табака обладают высоким морфогенетическим потенциалом, а также хорошо отзывчивы на изменения условий культивирования. Поэтому из листьев табака легко получить хорошо пролиферирующую каллусную ткань.

Каллусную ткань получают из сердцевидной паренхимы, листовых, черешковых и корневых эксплантов. Очень хорошо процесс каллусообразования происходит при поранении листьев. Для получения каллусной ткани можно изолировать листья как с интактных растений, так и с растений in vitro. Каллусообразование происходит с разной интенсивностью на средах с 2,4-Д и с НУК. Типы образовавшихся каллусов различаются также по внешнему виду и по способности к регенерации.

Материалы и оборудование: растения табака; этанол, 0,1%- ный раствор сулемы, колбы со стерильной водой (2 шт.), стерильные матрасики, стерильный скальпель, пинцет, пробирки со стерильной питательной средой МС.

Ход работы. Простерилизованные листья табака кладут на стерильный матрасик в ламинар-боксе, стерильным скальпелем вырезают сегменты длиной 1—1,5 см. Для лучшего каллусообразования делают поранения на вырезанных сегментах, после чего их переносят на питательную среду МС, содержащую 2,4-Д или НУК, и помещают в световую комнату или климатическую камеру. Через три недели рассматривают полученные результаты и записывают их в тетрадь.

Работа 2. Культивирование каллусной ткани из зародышей пшеницы

Объяснение. Каллусную ткань, полученную из зародышей пшеницы, применяют для исследований по клеточной селекции. Она может быть использована для получения суспензионной культуры, изолированных протопластов, растений-регенерантов, а также для количественного и качественного исследования вторичных метаболитов.

Материалы и оборудование: замоченные в течение суток зрелые семена пшеницы, пинцет, препаровальные иглы (4 шт.), скальпель, пробирки или чашки Петри со средой МС с добавлением 2,4-Д 3 мг/л — для зрелых зародышей и 2 мг/л — для незрелых; спиртовка, спички, стерильные матрасики или чашки Петри.

Ход работы. Для получении каллуса из зрелых зародышей пшеницы семена, замоченные за сутки до начала работы, стерилизуют в течение 25 мин в 0,1%-ном растворе сулемы или диацида, после чего их тщательно промывают 5 раз стерильной дистиллированной водой, кладут на стерильный матрасик и скальпелем изолируют зародыш. Все операции проводят в ламинар-боксе. Изолированные зародыши помещают на агаризованную питательную среду МС в пробирки или чашки Петри. Культивируют зародыши в климатической камере или световой комнате при температуре 25 °С. Через 3 недели рассматривают и зарисовывают образовавшийся каллус.

При получении каллусной ткани из незрелых зародышей их изолируют на 12-е сутки от начала цветения пшеницы. Семена стерилизуют 0,1%-ным раствором сулемы или диацида 7 мин с последующей пятикратной промывкой стерильной дистиллированной водой. С помощью препаровальной иглы и скальпеля изолируют асептически зародыши на стерильном матрасике или в чашке Петри. Зародыш переносят на питательную среду МС с добавлением 2 мг/л 2,4-Д. Пробирки или чашки Петри со стерильными зародышами помещают в климатическую камеру или световую комнату, где поддерживается температура 25 °С. Через 3 недели рассматривают и зарисовывают результаты.

Работа 3. Пассирование каллусной ткани и снятие ее ростовых характеристик (на примере картофеля)

Объяснение. Пассирование (пересадка) каллусной ткани проводится (в зависимости от интенсивности роста) по истечении 4—6 недель. Обычно цикл выращивания равняется 4 неделям. За это время для построения кривой роста каллус взвешивают 4 раза (через 7 суток), повторность трехкратная. Кроме снятия ростовых характеристик необходимо отмечать цвет и консистенцию каллусной ткани. Каллусная ткань картофеля в зависимости от сорта, применяемых гормонов и условий культивирования имеет белый, желтый, серый, светло-коричневый цвет, по мере старения он темнеет. Консистенция ткани бывает рыхлой и плотной. Для образования суспензии предпочтительнее использовать хорошо пролиферирующий, рыхлый каллус. Плотная каллусная ткань обычно применяется для морфогенеза.

Материалы и оборудование: каллусная ткань в чашках Петри; стерильные инструменты (скальпель, пинцет), стерильная бумага, фольга, чашки Петри со средой МС для культивирования каллусной ткани (3 шт.), аналитические весы, спирт в фарфоровом стаканчике, спиртовка, спички.

Ход работы. Открыть чашку Петри, пинцетом извлечь из нее каллусную ткань и перенести ее на пустую стерильную чашку Петри для деления на кусочки. Разделить каллусную ткань примерно по 100—150 мг. Аналитические весы протирают спиртом изнутри. На стерильной фольге осуществляют взвешивание каллусной ткани, которую затем помещают в чашки Петри на питательную среду. Чашки закрывают пищевой пленкой и помещают в световую комнату. Через 4 недели каллусную ткань стерильно взвешивают. Интенсивность роста (ИР) каллусной ткани рассчитывают по формуле

где сырая масса 1 — масса каллусной ткани в начале пассажа, мг; сырая масса 2 — масса каллусной ткани в конце пассажа, мг.

Работа 4. Индукция стеблевого органогенеза в культуре каллусной ткани картофеля

Объяснение. Для индукции органогенеза каллусную ткань, полученную из стеблевого или листового экспланта стерильного растения картофеля (второй и последующие пассажи), пересаживают на среду с высоким содержанием цитокининов, а для укоренения образовавшихся побегов используют среду с повышенным содержанием ауксинов. Индукция морфогенеза и регенерация растений — сложный, многоступенчатый процесс. У картофеля его можно подразделить на несколько стадий: индукция зеленых меристемати- ческих зон, появление почек de novo, формирование микропобегов с последующим их укоренением. Чем моложе каллусная культура (т. е. чем меньше времени прошло с момента ее получения), тем больше ее регенерационная способность. Состав сред для индукции морфогенеза и регенерации растения разных сортов картофеля неодинаковый, но общим правилом является повышенное содержание цитокининов (зеатина или БАП).

Материалы и оборудование: стерильные чашки Петри или пробирки, колба со средой для морфогенеза, длинный или короткий пинцет, стерильный матрасик, каллус картофеля в пробирке или чашки Петри, спиртовка, спички, вата.

Ход работы. Каллус вынимают из пробирки или чашки Петри, помещают на стерильный матрасик, разделяют ткань на кусочки размером 5x5 мм, после чего стерильным пинцетом переносят их на агаризованную питательную среду для индукции морфогенеза. Пробирку закрывают пробкой (в случае использования чашек Петри их закрывают парафилмом) и ставят в световую комнату с температурой 20—25 °С, освещенностью 3 тыс. лк и влажностью воздуха 70 %. Через 1 неделю отмечают появление структурированных очагов, а через 3—5 недель — меристематических зон яркозеленого цвета. Через следующие 1—2 недели отмечают появление апексов. Записывают количество апексов на каждом каллусе. При дальнейшем культивировании апексы превращаются в микропобеги. На одном экспланте может дифференцироваться до нескольких десятков побегов. Когда они достигнут высоты 10 мм, их отделяют от каллусной ткани и переносят на среду для укоренения. Через 5—10 дней отмечают появление корней.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >