Ситуационные задачи

  • 1. Известно, что для создания новых сортов растений используют метод отдаленной гибридизации. Однако в результате скрещивания двух генотипов возникает постгамная несовместимость, которая проявляется в низкой всхожести семян или полном ее отсутствии. Предложите технологию, направленную на сохранение полученных гибридов.
  • 2. При преодолении постгамной несовместимости растений применяют эмбриокультуру. Перечислите методы сохранения гибридных зародышей и выберите наиболее приемлемый метод для пшеницы, сосны и вишни.
  • 3. При гибридизации часто возникают физиологические и морфологические барьеры несовместимости родительских форм. Назовите метод, позволяющий преодолеть прогамную несовместимость растений.
  • 4. Для создания генофонда ценных клеток и тканей растений in vitro применяют метод криоконсервации. При данной технологии встречается ряд трудностей, связанных с защитой клеток и тканей от осмотического стресса и их механического разрушения в результате замораживания. Как защитить клетки от осмотического стресса и их механического разрушения в результате замораживания?
  • 5. При проведении работ по криосохранению необходимо учитывать специфику растительных клеток. Определите оптимальные режимы технологии криоконсервации каллусных и меристемных клеток. Назовите сходства и различия в технологиях.
  • 6. Одним из важных этапов получения нового селекционного материала является включение в селекционный процесс гаплоидных растений, которые получены путем андрогенеза. Какие факторы оказывают влияние на переход с гаметофитного на спорофит- ный путь развития микроспор in vitro?
  • 7. Оцените эффективность андрогенеза, гиногенеза и партеногенеза при получении гаплоидных растений. Объясните свой выбор.
  • 8. Возможно ли в культуре изолированных пыльников и микроспор получить DH-линии спонтанно или этот процесс находится под контролем действия определенных веществ?

Лабораторный практикум

Работа 1. Культура изолированных пыльников.

Получение гаплоидных растений

Объяснение. Культивирование in vitro пыльцы и пыльников позволяет получать гаплоидные растения и каллусные ткани. Это представляет большой интерес для генетики и селекции, так как у гаплоидов легче выявить и отобрать ценные мутации, а с помощью колхицина можно получить полностью гомозиготные диплоидные растения.

В условиях культуры in vitro индукция роста микроспор и образования эмбриоидов осуществляется двумя путями: прямым эмбриогенезом или через образование каллуса и индуцирование органогенеза. В обоих случаях процесс протекает иначе, чем в условиях in vivo. Образование гамет после одного-двух делений блокируется, в то время как вегетативная клетка делится как зигота и дает начало эмбрионам. Более желателен прямой андрогенез, при котором микроспора ведет себя как зигота и проходит целый ряд этапов эмбриогенеза, вплоть до образования на пыльнике растений. В случае непрямого андрогенеза микроспора дает начало каллусу, в котором на той же среде начинается образование эмбриоидов.

Индуцирование андрогенеза в наибольшей степени зависит от состояния пыльцы в момент введения ее в культуру in vitro. Пыльники рекомендуется брать в момент первого митоза или после его завершения. Для этой цели пригодны нераспустившиеся цветочные бутоны с пыльниками, содержащими одноклеточные микроспоры.

У многих видов наилучший выход микроспор обеспечивается при предобработке культивируемых пыльников низкими температурами. Например, у ячменя обработка в течение 28 дней при 4 °С или 14 суток при 7 °С дает оптимальные результаты.

Материалы и оборудование: цветочные бутоны растений; бинокулярная лупа; стерильные пинцеты, скальпели, пробирки или чашки Петри с питательной средой для пыльников; гипохлорит кальция или натрия или 0,1%-ный раствор диацида или сулемы; колбы со стерильной водой — 2 шт.; стерильные стаканчики — 2 шт.; спиртовка, спички, вата.

Ход работы. Микроспоры, выделенные из пыльников, окрашивают 3%-ным ацетокармином и с помощью микроскопа определяют стадию развития пыльцы в пыльниках. Отбирают бутоны с пыльниками, содержащими преимущественно одноядерные микроспоры.

Отделяют цветочные почки, помещают по 23 шт. в раствор гипохлорита или диацида на 5—10 мин, затем 2—3 раза промывают стерильной водой. Делают надрез на одной стороне почки и с помощью пинцета с тонкими кончиками собирают тычинки в стерильные чашки Петри. От тычинок отделяют тычиночные нити и помещают по пять пыльников в культуральный сосуд. Изолирование неповрежденных пыльников из очень маленьких цветочных почек следует проводить под бинокулярной лупой. У мелких бутонов удаляют только венчик и помещают целую почку на питательную среду таким образом, чтобы пыльники были в непосредственном контакте со средой. Наличие других частей цветка не влияет на развитие пыльцы.

Поврежденные пыльники обязательно отбраковывают, так как в противном случае это ведет к гибели всего пыльника и, кроме того, каллусная ткань может образовываться не из пыльцы, а из соматических диплоидных клеток.

Пыльники культивируют на агаризованной или жидкой питательной среде в пробирках или чашках Петри d = 5 см. Культуры инкубируют при 24—27 °С и экспонируют при освещенности около 2000 лк и 14-часовом дне. Важно, чтобы пыльники были отобраны из относительно молодых растений, выросших в нормальных условиях освещения. У старых растений к концу цветения образуются мелкие бутоны, которые содержат пыльники с гетерогенной смесью микроспор и дефективной пыльцой.

При культивировании пыльников, образующиеся из пыльцы растения за 3—8 недель достигают высоты около 5 см, после чего их вынимают из агара и пересаживают в горшки со стерильной почвой. В первое время горшки необходимо накрывать стаканом для создания влажной атмосферы.

Для образования эмбриоидов необходимы сахароза и железо. Сахарозу вносят в питательную среду в концентрации 2—4 %, но для некоторых пыльников (ячменя, томатов, пшеницы) она должна быть повышена до 6—12 %. Железо лучше применять в комплексе с хелатами (Fe ЭДТА).

Работа 2. Получение гаплоидных растений в культуре пыльников мягкой пшеницы

Объяснение. Гаплоидия — процесс, приводящий к получению растений с уменьшенным вдвое набором хромосом. В системах in vitro гаплоиды получают путем культивирования пыльников и микроспор. Поскольку гаплоиды, полученные в культуре пыльников, несут генотип мужской гаметы, этот процесс называется андро- генезом in vitro. Андрогенез может быть прямым и косвенным. При прямом андрогенезе образование гаплоидных растений-регенерантов происходит благодаря пыльцевому эмбриогенезу, т. е. из эмбриоидов, формирующихся путем деления микроспор. Микроспора ведет себя как зигота и проходит ряд этапов эмбриогенеза, иногда до образования на пыльнике растений. Возникновение гаплоидных растений из каллусов, которые образуются в результате дедифференциации микроспор, называется косвенным андрогенезом. При этом не все растения, регенерировавшие из каллуса, являются гаплоидными. В связи с этим для массового получения гаплоидов необходимо индуцировать пыльцевой эмбриогенез. При выделении пыльников из цветочных бутонов и помещении их на питательную среду индуцируется спорофитный путь развития микроспор. Внутри пыльника происходят многочисленные деления микроспор и образуется многоклеточный комплекс, из которого формируются различные андрогенные структуры (глобулы, эмбриоиды), дающие начало гаплоидным растениям. Индуцирование андрогенеза в наибольшей степени зависит от комплекса факторов, главными из которых являются генотип, физиологическое состояние донорного растения и экспланта, стадия развития пыльцы, состав питательных сред, условия культивирования и др.

Материалы и оборудование: молодые колосья пшеницы (до вы- колашивания) — 10 шт., стерильные чашки Петри с одним-двумя слоями фильтровальной бумаги — 3 шт., бинокулярная лупа, стерильные пинцеты для извлечения и переноса пыльников на питательную среду, стерильные стаканы — 3 шт., колба со стерильной дистиллированной водой, 0,1%-ный раствор сулемы для стерилизации колосьев, 3%-ный ацетокармин, колба с питательной средой МС, спиртовка, спички, ватный тампон для стерилизации ламинар- бокса и предметного столика бинокуляра.

Ход работы. Колосья пшеницы помещают для стерилизации в 0,1%-ный раствор сулемы и выдерживают 10—15 мин. Затем сулему сливают, а колосья промывают в 3—5 объемах стерильной дистиллированной воды, выкладывают в чашки Петри на фильтровальную бумагу. Под бинокулярной лупой, придерживая одним пинцетом колос, отгибают листовые обертки и извлекают пыльники (поврежденные отбрасывают), которые быстро переносят в чашки Петри с агаризованной средой МС, слегка вдавливая пинцетом для лучшего контакта со средой. Культуры инкубируют при 23— 25 °С без доступа света в течение 3—5 недель. Стадию развития пыльцы в пыльниках определяют цитологическим методом. Для этого пинцетом извлекают пыльники на предметное стекло и дробят на мелкие кусочки. Содержимое окрашивают ацетокармином с подогревом на спиртовке и определяют под микроскопом стадию развития пыльцы.

Работа 3. Культура изолированных зародышей

Объяснение. При отдаленной гибридизации наблюдается так называемая постгамная несовместимость, в результате чего зародыш остается недоразвитым и неспособным к нормальному прорастанию. Даже у щуплой зрелой зерновки можно извлечь зародыш и культивировать его на питательной среде без добавления гормонов, например на среде МС. При более отдаленных скрещиваниях нарушения в развитии зародыша иногда наблюдаются уже на ранних этапах, что выражается в замедлении темпов роста, отсутствии дифференцировки. Процесс культивирования такого зародыша состоит из двух этапов: эмбрионального роста, во время которого продолжается дифференциация, и его прорастания. Для первого этапа требуется более сложная питательная среда. Незрелые зародыши изолируют обычно через 2 недели после опыления, но этот срок может быть другим в зависимости от комбинаций скрещивания и погодных условий. Целесообразнее начать наблюдение за развитием гибридных зерновок уже с 9—10 суток после опыления и, обнаружив замедление или остановку роста, ухудшение внешнего вида зерновок, немедленно приступить к изолированию и высадке зародышей на питательную среду.

Материалы и оборудование: зрелые зерновки пшеницы; замоченные в воде за 1 сутки до занятий; пробирки со стерильной питательной средой МС; стерильные пинцет, скальпель, стерильные матрасики или чашки Петри; колба со стерильной водой, спиртовка, спички, марлевые стерильные мешочки.

Ход работы. Всю работу проводят в ламинар-боксе. Предварительно замоченные семена стерилизуют спиртом в течение 2—3 мин, затем помещают по 10—20 шт. в марлевые мешочки и стерилизуют в растворе диацида или сулемы 15 мин. Раствор сливают во флакон для повторных стерилизаций, а семена промывают 3—5 раз стерильной дистиллированной водой в том же стакане, в котором проводилась стерилизация. Пинцетом переносят зерновки на стерильный матрасик или в чашку Петри. Кладут зерновку бороздкой вниз и, придерживая пинцетом, остро отточенным скальпелем или иглой рассекают оболочку и выделяют зародыш. Повернутый щитком вниз зародыш переносят в пробирку или чашку Петри со средой МС без гормонов. Через 2—3 недели зарисовывают образовавшиеся из зародышей проростки.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >