Выделение, культивирование и слияние изолированных протопластов.

Для применения методов соматической гибридизации необходима разработка соответствующих технологий получения протопластов, способных делиться и регенерировать растения. Выделение протопластов растительных клеток путем их плазмоли- зирования и механического разрушения клеточной стенки было осуществлено еще в конце XIX в., а в 1909 г. Э. Кюстер наблюдал слияние таких протопластов. Однако метод изолированных протопластов получил развитие лишь после того, как И. К. Коккинг (1960) впервые осуществил ферментативное разрушение клеточной стенки и выделил голые протопласты (рис. 5.1), а в 1970 г. он добился индуцированного слияния протопластов за счет применения в качестве индуктора нитрата натрия. Разработанная методика оказалась малоэффективной и сейчас имеет лишь историческое значение.

Изолированные протопласты, полученные

Рис. 5.1. Изолированные протопласты, полученные:

а — из семядольной хвои сосны обыкновенной;

6 — из листовой пластинки табака

Для культивирования протопластов применяют те же питательные среды, что и для культуры изолированных клеток и тканей. Наиболее часто используются следующие основные среды: 1) модифицированная среда Мурасиге и Скуга; 2) среда Гамборга (В5), состав которой ранее был разработан для суспензионных культур сои. Однако данная среда оказалась пригодной для протопластов целого ряда видов растений, особенно для каллусных протопластов; 3) среда 8Р, представляющая собой сильно обогащенную витаминами, аминокислотами и сахарами среду Гамборга. Отличительной чертой всех сред для протопластов является отсутствие агара в питательной среде, а также повышенное осмотическое давление на начальных этапах культивирования. В качестве осмотиков обычно используют сахара: глюкозу, маннитол, сорбитол, сахарозу и ксилозу, иногда сочетание двух различных сахаров, а также СаС12.

Одним из технических условий при культивировании протопластов большинства видов является обеспечение определенной плотности высева клеток. В большинстве случаев эта величина составляет 104—105 кл/мл, а объем культуры — 2,5—10 мл.

В процессе культивирования изолированные протопласты регенерируют новую клеточную стенку (через 48 ч с момента выделения протопластов) и превращаются в обычные клетки, способные делиться и давать начало образованию каллусной ткани (рис. 5.2).

Слияние протопластов и формирование каллусной ткани

Рис. 5.2. Слияние протопластов и формирование каллусной ткани:

а — слияние протопластов; б-деление гибридной клетки;

в — формирование микрокаллуса; г — формирование каллусной ткани

Протопласты выделяют из каллусных, суспензионных клеток или из клеток листьев, меристем, стеблей. При выделении протопластов из листьев сначала удаляют эпидермис, лист нарезают на сегменты и затем подвергают энзиматической обработке пектиназой и цел- люлазой (рис. 5.3).

Слияние изолированных протопластов может происходить спонтанно, но довольно редко. Индуцированное слияние изолированных протопластов впервые было получено в лаборатории Э. Коккинга в 1970 г. В качестве индуктора ученые использовали нитрат натрия. Однако этот метод оказался малоэффективным, и сейчас найдены другие фьюзогены (индукторы слияния). Наиболее эффективными из них оказались растворы с высоким pH (9—11) и высокой концентрацией ионов кальция (100—300 мМ). Протопласты предварительно агглютинируют с помощью концентрированных растворов полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500—6000 М. Методика «полиэтиленгликоль — высокий pH — высокая концентрация Са2+» хорошо себя зарекомендовала и в различных модификациях используется в большинстве биотехнологических лабораториях. Применяя эту обработку, удается вовлечь в слияние до 10—50 % протопластов. Однако данный метод имеет недостатки: 1) сравнительно высокая летальность обработки (чем выше эффективность слияния, тем сильнее повреждаются клетки); 2) высокая частота образования многоядерных продуктов слияния, которые в большинстве случаев нежизнеспособны. Кроме того, даже неслившиеся клетки после обработки часто остаются слипшимися, что мешает в дальнейшем вести количественный учет событий гибридизации.

Схема получения и культивирования протопластов

Рис. 5.3. Схема получения и культивирования протопластов

Частота слияния протопластов, вероятно, не зависит от видовой принадлежности протопластов — компонентов системы. Значительно большее влияние на процесс слияния оказывает не только внешние факторы, но и ультраструктурная организация (тканевая принадлежность) клеток. Например, меристемные и каллусные протопласты очень легко заставить сливаться; значительно труднее этот процесс происходит у сильно вакуолизированных клеток и клеток с развитыми хлоропластами (в частности, трудно индуцировать слияние мезофильных протопластов).

У. Циммерман с сотрудниками разработали физический метод слияния протопластов животных клеток, липосом, в котором в качестве индуктора использовались импульсы электрического тока.

Слияние протопластов приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида (рис. 5.4)Ч Цибридная клетка содержит цитоплазму обоих партнеров, а ядро — одного. Это возможно в том случае, когда после слияния протопластов не происходит соединения ядер и одно ядро дегенерирует. Образование цибрида возможно и в том случае, если один из протопластов лишен ядра или оно инактивировано путем облучения. [1]

Схемы, иллюстрирующие наследование при парасексуальной гибридизации

Рис. 5.4. Схемы, иллюстрирующие наследование при парасексуальной гибридизации:

а — родительских ядерных (кружок) и внеядерных (овал) детерминант при парасексуальной (слева) и половой (справа) гибридизациях; б — при парасексуальной гибридизации с учетом как минимум двух независимых внеядерных генофоров; в — генетическое разнообразие парасексуальных потомков, возникающее дополнительно к цитоплазматическим гетерозиготам вследствие соматической сегрегации внеядерных генофоров 1

Цибридизация позволяет ввести цитоплазматические гены, несущие признаки ЦМС (цитоплазматической мужской стерильности), устойчивости к некоторым гербицидам и патогенам.

Описаны гибриды между протопластами эритроцитов крысы и протопластами дрожжевых клеток, между протопластами моркови и человека, табака и человека и др.

Первый неполовой межвидовой гибрид высших растений получен в 1972 г. путем слияния изолированных протопластов двух видов табака: Nicotiana glauca и N. langsdorfii. В 1978 г. Г. Мельхерс препринял попытку получить парасексуальный гибрид между картофелем и томатом. В этих экспериментах протопласты, полученные из каллусной ткани дигаплоидного картофеля сливали с мезофиль- ными протопластами хлорофильного мутанта томата типа Aurea с помощью стандартной методике «ПЭГ — высокий pH — высокое Са2+». В конкретных условиях культуры мезофильные протопласты томата также делились, однако их каллусные ткани не были способны к регенерации побегов. Среди большого количества зеленых регенерантов картофеля были обнаружены четыре морфологически ненормальные формы, несущие ряд признаков обоих родителей (форма листа, окраска цветков). Хромосомный анализ показал, что три растения из полученных имеют гиперамфиплоидное число хромосом (50—56 вместо 48), в то время как один гибрид имеет около 72 хромосом. Различить морфологически хромосомы картофеля и томата оказалось невозможно. При анализе полипептидов белка Фракция 1 в малой субъединице установлены полипептиды и типа картофеля, и типа томата. Большая субъединица (хлоропластные гены) в трех из четырех растений состояла из полипептидов типа томата, а у высокохромосомной формы обнаружены хлоропласты картофеля. Полученные гибриды были аномальными в отношении морфологии (махровые цветки, утолщенные корни, отсутствие выраженных столонов) и предположительно стерильными, что можно объяснить и их анэуплоидной природой, а не гибридностью. Здесь уместно вспомнить, что когда 40 лет назад Э. Кокинг описывал радужные надежды тех, кто надеялся получать гибриды с помощью слияния протопластов, он нарисовал томатофель — гибрид картофеля и томата — растение, ветви которого свисали под тяжестью томатов, а к столонам были прикреплены внушительного размера клубни. Есть, видимо, некая ирония в том, что у первого настоящего парасексуального гибрида томат + картофель нет ни «вершков», ни «корешков».

В настоящее время методом парасексуальной гибридизации получено большое число межвидовых, межсемейственных и меж- трибных гибридов. Однако во многих случаях гибридные растения, полученные таким путем, в той или иной степени анормальны. Примером может служить соматический гибрид между арабидопсисом и турнепсом, который является растением-монстром. Возникающие аномалии являются результатом хромосомной несбалансированности.

Для идентификации гибридов могут служить пластиды. Например, при слиянии протопластов табака и моркови в качестве селективных маркеров использовались зеленые хлоропласта табака и красно-оранжевые хромопласты моркови.

Использование изолированных протопластов в селекции растений не ограничивается возможностью их индуцированного слияния и получения соматических гибридов. Изолированные протопласты способны поглощать из окружающей среды макромолекулы и орга- неллы, следовательно, в них можно вводить чужеродную информацию, не пересаживая ДНК или органеллы других клеток. Уже проведена успешная трансплантация изолированных ядер в протопласты петунии и табака. Вместе с тем поглощение протопластами чужеродных ядер не всегда ведет к образованию гибридов. Кроме ядер в изолированные протопласты удалось трансплантировать чужеродные хлоропласта. Из этих протопластов А. Карлсон получил растения-регенеранты, содержащие хлоропласта другого организма.

В целом, как видим, использование изолированных протопластов в генетической реконструкции клетки открывает перспективы перед клеточной селекцией.

Контрольные вопросы

  • 1. Что такое изолированный протопласт?
  • 2. Кто впервые выделил изолированные протопласты? Из какого объекта?
  • 3. На чем основывается метод соматической гибридизации?
  • 4. Какие ферменты и осмотики применяют для изолирования протопластов?
  • 5. Из каких растительных объектов можно получить протопласты?
  • 6. Какие условия и питательные среды применяют для культивирования изолированных протопластов?
  • 7. Через сколько часов восстанавливается клеточная стенка у протопласта?
  • 8. Какое практическое применение имеет метод соматической гибридизации?

  • [1] Глеба Ю. Ю., Сытник К. М. Слияние протопластов и генетическое конструирование высших растений : монография. Киев : Наукова думка, 1982.
 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >