Генетические методы диагностики инфекционных заболеваний

1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Возможна идентификация микроба по молекуле ДНК, без выделения чистой культуры. ДНК накапливают с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этапы ПЦР представлены на рис. 9.7.

Схема полимеразной цепной реакции

Рис. 9.7. Схема полимеразной цепной реакции

  • 1- й этап. Денатурация и образование двух нитей ДНК путем ее отжига (t = 92—95°С).
  • 2- й этап. Добавление и связывание затравки (праймеров) при t = 37—60°С. Синтез дочерней нити ДНК.
  • 3- й этап. Добавление нуклеотидов и ДНК-полимеразы. Сшивка родительской и дочерней нити ДНК.
  • 4- й этап. Образование двух новых молекул ДНК. Повторение цикла с удвоением молекул ДНК.

Идентификация полученных молекул ДНК дает основание для распознавания вида бактерии или вируса. Метод используют в случае невозможности выделения чистой культуры микробов в воде, почве, продуктах, материале от больного.

2. Рестрикционный анализ проводится при помощи эндону- клеаз-рестриктаз, действие которых специфично. Каждая рестрик- таза (расшиватель) взаимодействует с определенным участком (сайтом) распознавания. В каждом микробе находится генетически детерминированное количество сайтов. Известно около 200 различных рестриктаз, для которых известны их сайты рестрикции (расшивания).

При постановке реакции ДНК обрабатывают рестриктазой (рис. 9.8, а) и определяют количество и длину полученных фрагментов (рис. 9.8, б) с помощью метода электрофореза. Сопоставляя данные идентифицируемого и стандартного штамма ДНК, определяют видовую принадлежность микроба.

Рестрикционный анализ молекулы ДНК

Рис. 9.8. Рестрикционный анализ молекулы ДНК

3. Молекулярная гибридизация. Молекула ДНК расплетается и распадается на две нити при температуре 90°С (рис. 9.9, а).

Метод молекулярной гибридизации

Рис. 9.9. Метод молекулярной гибридизации

Одну нить ДНК фиксируют на специальном фильтре и обрабатывают различными одноцепочечными ДНК с мечеными радиоактивными радионуклидами (зондами) (рис. 9.9, б). При идентичности сравниваемой цепочки и радиоактивного зонда образуется двуцепочечная ДНК (рис. 9.9, в), которую узнают по фиксации радиоактивной метки. Зная видовую принадлежность зонда, можно идентифицировать вид микроба, из которого выделили ДНК.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >