Индивидуальные характеристики гормонального статуса организма и разработка методов прогнозирования индивидуальной радиорезистентности с использованием комплекса показателей систем гормональной регуляции

Исходя из полученных результатов, далее была поставлена задача подтверждения возможности прогнозирования радиорезистентности животных выбранных групп с использованием комплекса показателей различных систем гормональной регуляции организма. Тем самым мы попытались проверить гипотезу о неспецифичности регуляторных механизмов, отвечающих за формирование индивидуальной неспецифической резистентности и радиорезистентности организма, и возможности использования для прогнозирования последних достаточно широкого комплекса показателей. Для этого в экспериментах, результаты которых представлены в данном, разделе, в качестве критериев оценки функционального состояния регуляторных систем организма, помимо исходных показателей содержания в периферической крови гормона надпочечников кортикостерона, использовались также данные об исходном состоянии функциональной активности щитовидной железы по показателям содержания в периферической крови крови гормонов тироксина и трийодтиронина.

Эксперименты были проведены на самцах крыс линии Вистар (первая партия крыс 35 голов и вторая партия 28 голов) в возрасте 2—3 месяца и массой к началу опытов 180—250 г. Все животные были индивидуально помечены специальной меткой. Индивидуальные показатели функциональной активности коры надпочечников оценивали по содержанию глюкокортикоидов (кортикостерона), а функциональной активности щитовидной железы — по содержанию гормонов тироксина (Т₄) и трийодтиронина (Т₃) в плазме крови экспериментальных животных.

Для анализа содержания гормонов кровь у крыс брали с помощью обычной инъекционной иглы из хвостовой вены после предварительного (в течение 5 минут) нагревания хвоста от лампы накаливания. Общий объем отбираемой для анализа крови составлял около 1 мл. Для повышения статистической достоверности и более точного определения среднего индивидуального значения концентрации кортикостерона у отдельных животных и среднего значения, характерного для всей группы животных (нормы для крыс), пробы отбирали двукратно с недельным интервалом.

Концентрацию гормонов определяли в сыворотке крови. Кровь оставляли при комнатной температуре на 2—3 часа, затем сгустки «обводили» стеклянной палочкой и центрифугировали 10 мин. при 3000 об./мин. на центрифуге ОПН-34ХЛ4.2; повторное центрифугирование позволяло избавиться от примеси эритроцитов. Содержание гормонов определяли иммуноферментным (Т₃ и Т₄) и радиоиммуноло- гическим (кортикостерон) методами.

Содержание кортикостерона (КС) в сыворотке крови животных определяли радиоиммунологическим методом с использованием набора реактивов РИН-В-³Н (НИИ эндокринологии РАМН). Пробы сыворотки экспериментальных животных вносили в инкубационную среду, содержащую кроличьи антитела к кортикостерону и ³Н-кортикостерон. По окончании периода инкубации не связавшийся с антителами гормон сорбировали активированным углем, уголь отделяли центрифугированием, а в надосадочной жидкости определяли радиоактивность связавшегося с антителами меченого кортикостерона. Поскольку содержащийся в сыворотке экспериментальных животных кортикосте- рон, конкурируя с меченым гормоном, вытесняет его из мест связывания на антителах, радиоактивность связавшегося ³Н-кортикостерона определяется концентрацией немеченого гормона — чем она выше, тем ниже радиоактивность. Проводя реакцию в присутствии заданных количеств немеченого гормона, строят калибровочную кривую, позволяющую определить концентрацию гормона в экспериментальных образцах. Важной особенностью методики является необходимость инактивации содержащихся в экспериментальных образцах транскор- тинов (транспортных белков, связывающих КС) путем прогревания исследуемой сыворотки при 60° С перед проведением анализа.

Перед анализом исследуемые сыворотки разводили буферным раствором (БР) в 25 раз (1 : 24) и прогревали в течение 30 мин. при 60°С. БР содержал ОД М натрий-фосфатный буфер pH 7,4; 0,9 % NaCl и 0,1 % желатины. Растворы антисыворотки и ³Н-кортикостерона готовили непосредственно в день проведения анализа. Лиофилизиро- ванный препарат антисыворотки разводили БР так, чтобы конечное разведение сыворотки составляло 1 : 2000. Раствор ³Н-кортикостерона в смеси толуол : этанол (9 : 1) (приблизительно 180 мкл, радиоактивность 5000 срм/мкл) переносили из запаянной ампулы в сцинтилля- ционный флакон и высушивали под вакуумом водоструйного насоса до исчезновения запаха толуола. Высушенный ³Н-кортикостерон растворяли в 15 мл БР. Для приготовления проб калибровки спиртовой раствор кортикостерона (2 мкг/мл или 5,772 мкмоль/л, фактор пересчета 2,886, мол. масса кортикостерона 346) разводили в 50 раз БР (100 мкл спиртового раствора в 4,9 мл БР; концентрация 115,6 нмоль/л). Из полученного раствора путем последовательных разведений 1 : 1 в БР готовили серию калибровочных проб с концентрацией кортикостерона 57,8; 28,9; 14,45; 7,23 и 3,61 нмоль/л. Инкубационная смесь содержала 50 мкл БР, 50 мкл исследуемого образца сыворотки (разведенной в 25 раз и прогретой при 60°С) или калибровочного раствора КС, 100 мкл раствора ³Н-КС и 100 мкл раствора антисыворотки. Дополнительно готовили пробу В₀, не содержащую КС (по 100 мкл БР, ³Н-КС и ФС) и пробу В (200 мкл БР и 100 мкл ³Н-КС).

Перед инкубацией все пробы прогревали 10 мин. при 60°С. Инкубацию проводили при 37°С в течение 30 мин. По окончании инкубации пробы переносили в ледяную баню и добавляли 0,5 мл 1 % суспензии активированного угля в БР, охлажденной до 0—4°С и интенсивно перемешивали. Необходимо, чтобы время между добавлением суспензии угля в первую и последнюю пробы не превышало 2 мин. Пробы инкубировали с углем 10 мин. (с момента добавления угля в первую пробу), а затем центрифугировали в течение 10 мин. при 5000 об/ мин. на центрифуге ОПН-8 (с угловым ротором на 24 пробирки) при 4°С. Надосадочную жидкость переливали в сцинтилляционный флакон и добавляли 6,5 мл жидкого сцинтиллятора (смесь раствора РРО

4 г/л и РОРОР ОД г/л в толуоле с Тритоном Х-100 в отношении 3:1). Радиоактивность определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике «RackBetta 1215» (ЛКБ, Швеция).

Пробы обрабатывали сериями по 24 образца (в дупликатах). Каждая серия помимо экспериментальных образцов содержала пробы В, В₀ и калибровочные пробы (в диапозоне концентраций КС 14,45— 115,6 нмоль/л). Для каждого экспериментального и калибровочного образца вычисляли отношение В_х/В₀ х 100 %. Содержание КС определяли по калибровочной зависимости в координатах «концентрация КС — В_х/В₀ х 100 %», построенной по методу «от точки к точке» (point-to-point). Замеры проб В и В₀ показали, что при обработке углем удаляется 99,3 % не связанного с антителами КС, а максимальное связывание КС с антителами (В₀/Т х 100, где Т — общая радиоактивность вносимого в пробу ³Н-КС) составляет 25—30 %. Величины В_х/В₀ х 100 % для калибровочных проб варьировали от 100 % до 25—30 % (при 115,6 нмоль/л КС).

Для определения содержания общего Т₃ и Т₄ использовали иммуно- ферментные наборы. По 20 мкл сыворотки крови в дубликатах вносили в лунки полистироловых планшетов, предварительно покрытых поликлональными кроличьими антителами к Т₃ или Т₄. Затем вносили в лунки 200 мкл раствора конъюгата тироксина или трийодти- ронина с пероксидазой хрена в барбитуратном буфере (pH 8,6), содержащем деблокирующий агент — 8-анилин-1-нафталинсульфокислота (АНС), перемешивали и инкубировали либо 2 часа при 25°С либо 1 час при 37°С. После инкубации смесь удаляли, лунки трижды отмывали фосфатно-солевым буфером (pH 7,0) с добавлением Твин-20 от остатков конъюгата и вносили субстратно-хромогеновый буфер (раствор перекиси водорода и о-фенилаланина в цитратном буфере pH 4,3). После 20 мин. инкубации при комнатной температуре реакцию останавливали добавлением 4М серной кислоты. Планшет сканировали на 8-лучевом фотометре «Мультискан MS» (Labsystems, Финляндия) при длине волны 492 нм. Калибровочные пробы присутствовали в каждом планшете. Содержание гормонов (в нМоль/л) определяли по калибровочной кривой, построенной в полулогарифмических координатах.

Через неделю после последнего обследования крыс подвергали равномерному облучению на гамма-установке с источником ⁶⁰Со с мощностью дозы 2,14 сГр/с в дозах, близких к среднелетальной LD 50/30, которые были предварительно определены в результате снятия дозовой кривой на партии пробно облученных животных данной популяции. Определяли выживаемость крыс в ближайшем периоде после облучения (к 30 суткам) и время гибели павших животных. Первая партия (35 крыс) была облучена в августе в дозе 760 сГр. При этом средняя выживаемость в группе составила 57,2±8,3 %. Вторая партия была облучена в октябре в дозе 770 сГр, и средняя выживаемость в группе оказалась равной 28,7 %.

Для количественной оценки функционального состояния систем гормональной регуляции использовали логарифмический показатель, который вычисляли по формуле:

где (N^O/QV;) — значение концентрации гормона у отдельного животного по отношению к норме (среднему значению, определенному по большой выборке).