Анализ биотехнологий получения кормового витамина В12

Объем мировой продукции витамина В12 составляет порядка 20 тыс. т. Из них 54 % расходуется для приготовления фармацевтических и диетических добавок, остальные 46 % используют в качестве ростовых факторов в кормах для животных.

В настоящее время в литературе описано много способов выращивания микроорганизмов в целях получения витамина В12. Технологические процессы различаются продуцентами, анаэробными или аэробными условиями, параметрами кислотности и температуры среды и т. п. В то же время для микробиологических способов биосинтеза витамина характерны некоторые общие положения:

  • • влияние скорости обмена среды на удаление токсичных метаболитов;
  • • сильная зависимость процесса биосинтеза от состава питательной среды, в том числе от компонентов, вносимых в питательную среду: источника углерода, минерального питания, факторов роста, стимуляторов синтеза кобаламинов.

Именно составом питательной среды различаются многочисленные способы биосинтеза витамина В12. При этом многие факторы роста одинаково воздействуют на совершенно различные культуры в отношении синтеза витамина В12.

Во Франции осуществлен процесс производства витамина В12 при выращивании микроорганизмов Bacillus, Propionibacterium на сусле маниоки, которое является доступным, дешевым и экономически рентабельным сырьем [174]. В качестве других источников углерода могут служит глюкоза, сахароза, декстрин, крахмал, меласса. Изучено влияние на биосинтез витамина экстрактов кукурузы, люцерны, вики и клевера. Показано, что добавление кукурузного экстракта, содержащего неорганический фосфор в количестве 200—225 мг/л, является оптимальным при синтезе витамина.

Разработана [175] технология получения кормового витамина В12 при термофильном метановом брожении на сырьевой основе из выжимок яблок в сочетании со спиртовой бардой. Получен концентрат с содержанием витамина В12 18—20 мкг/кг.

Отмечается высокая эффективность добавок эфиро-метанольной фракции при биосинтезе витамина В12 в процессе метанового брожения последрожжевой барды [176].

В США [177] разработан способ повышения выхода витамина В12 в процессе ферментации метанобразующих бактерий, заключающийся в том, что в течение 4—7 сут ежедневно добавляют концентрат с источником углерода, более 90 % которого составляет метанол. Источником азота являются соли аммония неорганических кислот, при этом поддерживается массовое соотношение N:C, равное 1:11—1:15. Это обеспечивает увеличение в 4 раза общей усвояемости азота в культуральной жидкости.

Автолизат избыточных пивных дрожжей, приготовленный обработкой суспензии дрожжей концентрированной НС1 в течение 3—4 сут при температуре 30°С, стимулировал рост Rhodosporidium diobavatum при непрерывном культивировании на минеральной среде с парафином. Стимулирующий эффект от внесения автолизата при культивировании ауксогетеротрофного штамма Candida boidinii был равен эффекту от добавки смеси витаминов — биотина и тиамина [178].

Добавление дрожжевого экстракта в количестве 10—100 мг/л ускоряло образование производных витамина В12 при аэробном способе получения витамина при культивировании Artrobacter на углеводородах, в основном гексадекане [179].

Стабилизирующее действие при термическом воздействии на витамин В12 оказывали тиамин, рибофлавин, цианистый калий и нитрит натрия.

Суббактериостатические дозы антибиотиков (метицилина, окси- мицина, стрептомицина, мономицина, полимиксина, доуранозидола) увеличивали биосинтез витамина Propionibacterium shermanii, а бен- зиленпеницилин, ампиницилин, антибиотики тетрациклинового ряда, олеандомицин, олететрин, левомицин и доуродолин в таких же концентрациях ингибировали этот процесс [179].

Много работ посвящено изучению влияния спиртов, в частности метанола, на биосинтез витамина В12 [172, 180, 181]. Использование метанола в качестве углеродного питания позволяет увеличить скорость образования витамина В12 метанобактериями. Рекомендуется, в частности, при метановом брожении в целях повышения выхода витамина добавлять в культуральную жидкость метанол или этанол в количестве 1—1,5 %. Рассмотрен оптимизированный способ биосинтеза цианкоба- ламина, заключающийся в том, что в культуральную жидкость, содержащую 10—11 000 у/л витамина В12, вводят концентрат питательных веществ с массовым соотношением аммиачного азота и метанольного углерода 1:10—1:15, при этом концентрация метанола составляла 0,5—

1,5 %. Способ обеспечивает выход витамина до 40 000 у/л.

Оптимальный диапазон концентраций при использовании метанола 0,5—1,5 %, по данным [181].

Японские исследователи, изучая различные штаммы бактерий, способных к образованию витамина В12, установили, что при использовании метанола в качестве единственного источника углерода биосинтез активизировала добавка в среду кобальта, пептона, кукурузного экстракта и доноров метальных групп, бетаина, метионина [182]. Нуклеиновые кислоты, органические кислоты цикла Кребса и предшественники молекулы витамина В12 (глицин, сукцинат) не стимулировали синтез витамина. Максимальное накопление витамина наблюдалось при культивировании бактерий на среде, содержащей 1 % метанола, 0,1 % пептона, 1 мг/л сернокислого кобальта.

Добавление в среду мясного экстракта, аминокислот казеина или пептона стимулировало синтез витамина при культивировании в мета- нольной среде Pseudomonas species АМ-1 и Micrococcus eburneus [183]. Оптимальная концентрация метанола в среде составляла 2 %, хлористого кобальта 2 мг/л. Эти культуры хорошо усваивали также 1,2-про- пандиол, этанол, глицерин и глюкозу. Pseudomonas АМ-1 синтезировал витамин только на среде с метанолом или пропандиолом в количестве 156 и 118 мкг/л, соответственно, a Micrococcus eburneus образовывал витамин в количестве 80—110 мкг/л на всех субстратах.

Опыты по культивированию Methanobacillus kuznecovii на отходах ацетонобутилового и спиртового производства, содержащих метанол, показали, что клетки накапливали витамин В12 в количестве 1320 мг/л, не образуя при этом порфиринов. Добавление в среду 8-аминолевули- новой кислоты в количестве 10 мг/л инициировало синтез порфиринов, при этом синтез витамина В12 повышался. 8-Аминолевулиновая кислота стимулировала также синтез порфиринов культурой Propioni- bacterium shermanii. Добавка железа и кобальта угнетала синтез порфиринов, даже в присутствии 8-аминолевулиновой кислоты. Хлорамфени- кол подавлял рост бактерий. В его присутствии продуктивность клеток по биосинтезу порфиринов уменьшалась, а по биосинтезу витамина

В12 не изменялась. Добавление 8-аминолевулиновой кислоты снимало угнетающее действие хлорамфеникола на синтез порфиринов.

В США предложен способ получения витамина В12 при культивировании Artrobacter nyalinus на среде, содержащей этиловый спирт или ацетон, или Rhodopseudomonas sp. на среде, содержащей пропионат в качестве источника углеродного питания [184]. Добавка в среду хлористого кобальта и дрожжевого экстракта значительно ускоряла рост бактерий и накопление витамина до его содержания в клетках Rhodopseudomonas sp., равного 67 у/г сухой массы, что было в 2—3 раза выше по сравнению с контролем.

Содержание витамина В12 в клетках бактериальных культур, выделенных из проб донного или морского ила, повышалось в присутствии мальтозы, лактозы, глюкозы и арабинозы. Соли кобальта в концентрации 0,1—5,0 у/мл также значительно повышали содержание витамина. Наиболее эффективным оказался хлористый кобальт, в присутствии которого содержание витамина в клетках повышалось в 3 раза. Предшественники витамина В12, такие, как [3-аланин, L-глютамин, бензимидазол, 5-фенилдиамин и особенно L-пролин и L-аспарагин в концентрации 5 г/л стимулировали синтез витамина В12, но слабо влияли на рост клеток. В то же время D, L-a-амино-п-масляная, L-аспарагиновая, L-глютаминовая кислоты угнетали рост клеток и биосинтез витамина В12 [185].

Бесклеточные фильтраты культур Lactobacillus helveticus, streptococcus thermophilis стимулировали образование витамина В12 и летучих кислот в культурах пропионовокислых бактерий. В процессе культивирования Propionibacterium shermanii на среде, содержащей 3 % глицерина и 5 % молочной кислоты, образование витамина В12 повышалось при добавлении глюкозы (2,5 %), в то время как добавление галактозы и глюкозы способствовало в большей степени накоплению биомассы [186]. Дополнительное внесение лактозы изменяет ход и продолжительность ферментации, увеличивает биосинтез витамина В12. Максимальное накопление витамина получено на лактозе (2 %) при времени ферментации 72 ч (186 мг/л). На среде с сывороткой выход витамина составил 17,8 мг/л. Необработанная сыворотка, обогащенная кобальтом и железом, наиболее продуктивная среда для получения корриноидов. Депротеинизация сыворотки снижала выход биомассы бактерий и приводила к накоплению значительного количества порфиринов вследствие подавления синтеза корриноидов. Добавление кобальта и железа частично снижало эффекты, вызванные депротеинизацией сыворотки. Стимулирующее действие оказывало также добавление кефирной сыворотки, при этом бактерии синтезировали до 30—50 мг/л витамина В12.

Для увеличения выхода витамина В12 предлагают добавлять в среду, мг/л: глицин 15; сукцинат 15; сырую печень 200; сухие дрожжи 200; кукурузный экстракт 300; сульфат цинка 15; сульфат никеля 10 [187].

При изучении биосинтеза витамина В12 культурой Pseudomonas denitrificans установлено, что метионин, 5-аминолевулиновая кислота, янтарная кислота и 1-амино-2-пропанол не влияют на синтез витамина. Биосинтез витамина стимулировали глутаминовая, щавелевая, молочная кислоты, 5,6-диметил бензимидазол и молибден, причем добавление в среду 0,04 % щавелевой кислоты приводило к уменьшению концентрации витамина на 20 %.

Установлено, что при периодическом культивировании метано- бразующих бактерий на последрожжевой барде большинство аминокислот утилизируется уже в первые 2 сут. Наиболее интенсивно утилизируются аспарагиновая кислота, аланин, глютаминовая кислота и у-аминомасляная кислота. При непрерывном культивировании наиболее интенсивное потребление аминокислот, особенно тирозина, аспарагиновой кислоты и аргинина наблюдалось при 15—20 %-ом обмене среды в метантенке.

Изучено влияние некоторых сочетаний аминокислот на биосинтез витамина В12 культурой Azotomonas insolitia. Проведенные опыты показали, что добавление аминокислот (серина, аргинина и глицина) к питательной среде, содержащей аспарагиновую и глютаминовую кислоты, значительно повышало синтез витамина В12. При культивировании Streptomyces aureofaciens наибольший выход витамина наблюдался в присутствии L-глютаминовой кислоты. Стимулирующее действие на синтез витамина оказывал гидрохинон, при его добавлении в среду содержание витамина составляло 6,49 у/мл среды или 89 у/г сухого мицелия.

Для интенсификации и увеличения выхода витамина В12 в сбраживаемую среду вводят мочевину в количестве, не превышающем 300 г/м3 [188]. Влияние мочевины на выход витамина 2 определяется концентрацией ее в среде, наибольшее количество витамина В12 образуется на среде с 0,25 %-й мочевиной (116,8 % контроля). С увеличением концентрации мочевины от 0,6 до 1,0 % синтез витамина В12 ингибируется. Повышение выхода витамина на среде с 0,20 %-й мочевиной определяется не количеством азота, а особыми свойствами мочевины.

Установлено, что одновременное добавление мочевины и сульфата аммония (по 1,5 г/л) стимулирует образование витамина В12 значительно сильнее, чем каждое из веществ в отдельности, так как в таких условиях создается оптимальное значение pH.

Изучение влияния различных источников азота на синтез витамина и порфиринов бактериями Propionibacterium shermanii показало, что в отсутствие аммонийного азота витамин В12 не накапливается в клетках бактерий даже при добавлении в инкубационную среду 5-аминолевулиновой кислоты. При культивировании Bacillus badius в качестве источника азота культура использовала различные аммонийные соли и дрожжевой экстракт, но наибольший выход витамина В]2 получен на среде с фосфорнокислым аммонием (0,556 г/л) [189]. Рост и образование витамина стимулировали при добавлении в среду мясного или солодового экстракта в концентрации 0,3—0,6 г/л и ионов металлов Со2+ и Fe2+.

Добавление сульфата аммония при культивировании Propionibacte- rium shermanii повышало выход витамина В12 [190]. При этом оптимальным являлось соотношение аммонийной и аминной форм азота, равное 3:1. Стимулирующее действие NH% на увеличение выхода витамина объясняется тем, что в присутствии NH% культура использует разнообразные аминокислоты, а в отсутствие NH% — только некоторые. Биосинтез витамина повышался в присутствии тиамина, урацил оказался неэффективен. Формальдегид в количестве 0,125—0,25 % подавлял образование витамина В12 активным илом. Выращивание микроорганизмов активного ила на МПА в большинстве случаев приводило к снижению и потере витаминообразующей способности. Максимальное накопление витамина составило 3,5 мкг/мл.

Изучали влияние микроэлементов на образование витамина В12 [191, 192]. Ионы Mg2+, Mn2+, Cu2 + , Zn2+, Со2+ в количестве 0,5— 200 мг/л усиливают биосинтез витамина В]2 при культивировании ризосферных микроорганизмов кукурузы и картофеля. А при культивировании метанолусваивающих бактерий Klebsiella установлено, что ионы Zn2+ угнетают рост и образование витамина В12, Fe2+, Са2+, Мп2+ стимулируют эти процессы. В отсутствие Со2+ витамин В12 не образуется. Оптимальное значение pH для максимального синтеза витамина 7,0. Для биосинтеза витамина В12 культурой Propionibacterium shermanii необходимы кобальт и железо, тогда как для роста клеток необходимы магний и железо. Сернокислый цинк в концентрации 0,001 % снижает накопление биомассы более, чем в 2 раза. Еще более токсичное действие на витаминообразование оказывает цинк. Ингибирующее действие ионов цинка при pH более 7,0 возрастает. Стимулирующее действие на биосинтез цианкобаламина метанобразующими бактериями оказывает азотнокислый никель, выход витамина при этом увеличивается на 32 %. Наиболее эффективный источник фосфора при культивировании пропионовокислых бактерий — кукурузный экстракт, содержащий 200—225 мг/л фосфора. Содержание Со в кукурузном экстракте в концентрации 48—60 мкг/г не влияло на синтез витамина. Сернокислый марганец в концентрации 0,01 % снижал синтез витамина на 34 %.

Особую роль в синтезе витамина играет добавление Со2+ в питательную среду. Максимальное накопление витамина наблюдали при добавлении 100 мг/л хлористого кобальта. При синтезе витамина культурой Achromobacter cobalamini нормальное развитие культуры обеспечивала добавка кобальта в следовых количествах. Внесение 0,1 мг/л хлористого кобальта стимулировало биосинтез кобаламина в 30 раз, лишь незначительно влияя на рост культуры [192]. Увеличение содержания кобальта в среде стимулировало синтез витамина и угнетало накопление свободного порфирина. Есть данные, что добавление солей кобальта увеличивает содержание витамина В12 в пять и более раз [193].

В процессе биосинтеза витамина В12 на отходах ацетонобутилового производства лучшие результаты получены при внесении в культуральную среду углекислого цинка (10 мг/л), выход витамина при этом повышался на 50 %. Добавка диаммонийфосфата в количестве ОД % увеличивала выход витамина В12 на 44 % [194].

Использование в качестве стимуляторов синтеза витамина В12 солей никеля, в частности, комплексного соединения никеля, в котором никель связан с азот-, углерод- и кислородсодержащим полиацетатным хелатобразующим лигандом, приводит к интенсификации процесса синтеза витамина В]2. В качестве продуцента витамина В12 использовали смешанную культуру метанобразующих бактерий, используемую в крупнотоннажном производстве кормового витамина В12. Ассоциация микроорганизмов была представлена сапрофитными анаэробными бактериями, сбраживающими углеводы, аммонифицирующими бактериями родов Clostridium, Bacillus и др., ацетогенными бактериями родов Syntrophobacter, Desulfovibrio, сульфатвосстанавливающими и метанобразующими бактериями родов Mycobacterium, Pseudomonas, Methanobacterium. Процесс сбраживания осуществляли при оптимальном термофильном режиме брожения — при температуре 52—53°С, полунепрерывным методом с ежесуточной заменой культуральной среды в количестве 10 % объема метантенка. Питательная среда для сбраживания содержала ацетонобутиловую барду или спиртовую барду (табл. 6.29), 2—3 % метанола, 1,5-102 — 4,0-10_2 % мочевины, 1,0-10-2 — 2,О10-2 % хлористого кобальта, 1,ОЮ-2— 2,5-10-2 % диаммонийфосфата.

Таблица 6.29

Химический состав ацетонобутиловых и спиртовых бард

Компонент

Массовая доля компонента, %

Ацетонобугиловая барда

Спиртовая барда

Сухие вещества

1,9—2,6

5—8

Углеводы

0,2—0,6

0,5—6,8

Азот общий

0,08—0,10

0,15—0,22

Азот белковый

0,04—0,06

0,02—0,04

Зола

0,3

1,0-1,4

Добавление комплексных солей никеля, как видно из данных табл. 6.30 и 6.31, позволяет увеличить концентрацию витамина с 720 до 950 мкг/л, а долю цианкобаламина в общей сумме кобалами- нов — на 10—12 %, при этом по сравнению с контролем отмечалось увеличение производительности процесса на 13—15 % [194].

Было исследовано влияние добавок этилового и метилового спиртов совместно с 5,6-диметилбензил-мидазолом (5,6-ДМБ) в питательную среду, содержащую спиртовую барду, на процесс синтеза витамина В12 ассоциацией метанобразующих культур. Установлено [194], что при добавлении этилового спирта концентрация витамина В12 в культуральной жидкости возрастает на 120 % по сравнению с контролем, а при добавлении метилового спирта — в 3 раза (табл. 6.32).

Таблица 6.30

Влияние комплексного соединения никеля на интенсивность накопления витамина В12 в культуральной жидкости

Концентрация соли никеля, %

Содержание в культуральной жидкости

рн

сухих веществ, %

витамина В12, мкг/л

Контроль

2,28

720

7,3

ОД-КН

2,20

720

7,3

ОД-Ю-4

1,0

830

7,5

1-10-4

0,9

950

7,6

1,5-10-4

1,1

960

7,7

Таблица 6.31

Фракционный состав кобаламинов при добавлении в питательную среду комплексных солей никеля

Концентрация соли никеля, %

Суммарное коли- чество кобаламинов, мкг/л

Содержание компонентов, %

цианкоба-

ламины

фактор III

аналоги

Контроль

720

40

51

9

0,5-10^

830

45

50

5

1,0-10-4

950

45

52

3

При добавлении 5,6-ДМБ содержание витамина увеличивается только на 50 %, в то время как при добавлении двух активных компонентов: спирта и 5,6-ДМБ возникает синергетический эффект и концентрация витамина значительно увеличивается — в А—5,5 раза.

В табл. 6.33 приведен состав образующихся кобаламинов. Видно, что при добавлении в среду как этилового, так и метилового спирта, а также при совместном добавлении спирта и 5,6-ДМБ в культуральной среде увеличивается содержание кислых продуктов, что свидетельствует о более глубоком протекании процесса брожения.

При добавлении смеси этилового спирта и 5,6-ДМБ не происходит повышения содержания истинной формы витамина по сравнению с контролем.

При добавлении смеси метилового спирта и 5,6-ДМБ содержание истинной формы витамина В12 увеличивается на 50 %, в то время как добавление только метилового спирта не только не увеличивает, но и снижает содержание истинной формы витамина В12. В результате проведенных исследований авторы разработали питательную среду для процесса брожения ассоциации метанобразующих микроорганизмов, на которой выход витамина В12 увеличивался на 40—50 %. Полученные высокие показатели концентрации витамина В12 на разработанной питательной среде позволили рекомендовать данный процесс для промышленного получения не только кормовых концентратов витамина В12, но и кристаллического витамина В12 для медицинских целей.

Таблица 6.32

Влияние добавок этилового спирта, метилового спирта и 5,6-ДМБ на образование продуктов метанового брожения

Добавка

Кислые продукты брожения, г/л

Увеличение содержания витамина В12 в культураль- ной жидкости по сравнению с контролем,%

летучие

кислоты

молочная

кислота

Контроль

0,36

0,54

Этиловый спирт, 1 %

1,08

10,43

120

Метиловый спирт, 1 %

2,53

8,76

200

5,6-ДМБ, 5 мг/л

0,38

0,62

50

Этиловый спирт 1 % + 5,6-ДМБ, 5 мг/л

1,12

9,87

300

Метиловый спирт 1 % + 5,6-ДМБ, 5 мг/л

2,76

9,03

450

Таблица 6.33

Влияние добавок этилового спирта, метилового спирта и 5,6-ДМБ на состав кобаламинов

Добавка

Состав кобаламинов, %

истинный витамин В]2

фактор

III

фактор В

прочие

факторы

Контроль

52

27

14

7

Этиловый спирт, 1 %

52,5

29

16

2

Метиловый спирт, 1 %

37

44

17

2

5,6-ДМБ, 5 мг/л

55

27

10

8

Этиловый спирт,

1 % + 5,6-ДМБ, 5 мг/л

48

73

16

1

Метиловый спирт,

1 % + 5,6-ДМБ, 5 мг/л

75

16

22

0

Итак, многими исследователями были испытаны самые разнообразные питательные среды, содержащие различные источники углерода, от углеводов до углеводородов, различные источники азота, от солей аммония до аминокислот, различные сочетания минерального питания и самые разнообразные активные добавки.

Анализ рассмотренных выше работ показывает, что для биосинтеза витамина В12 наиболее оптимальным источником углерода являются углеводы, и среди них — моно- и дисахариды, и чаще всего глюкоза и сахароза.

Наиболее эффективными стимулирующими добавками являются различные растительные экстракты, такие как кукурузный и дрожжевой экстракт, а также сочетание солей кобальта с метиловым спиртом.

Фармацевтическая фирма Merck (США) получает витамин В12 с помощью высокоактивного мутантного штамма Pseudomonas denitrificans в аэробных условиях. Засевной пул культуры готовят на среде следующего состава: меласса 60 г, пекарские дрожжи 1 г, N-нитрозоамин 1 г, диаммонийфосфат 1 г, сульфат магния 200 мг, сульфат цинка 20 мг, молибдат натрия 5 мг, водопроводная вода 1 л; pH среды 7,4. Ферментацию проводят на среде следующего состава, г/л: меласса 100; пекарские дрожжи 2; диаммонийфосфат 5; сульфат магния 3; сульфат марганца 0,2; нитрат кобальта 0,188; сульфат цинка 0,02; молибдат натрия 0,005; 5,6-ДМБ 0,025; pH среды 7,4. Ферментацию проводят в течение 90 ч при температуре 29°С при перемешивании 420 мин-1 и аэрации 0,2 м3/ч. Накопление витамина В12 достигает 59 мг/л. Дальнейшее его выделение и очистка включают прогревание культуральной жидкости при 120°С в течение 30 мин, перевод экстрагированного витамина в цианоформу добавлением цианистого калия, фильтрацию, двукратную экстракцию корриноидов органическими растворителями (смесью крезол-четыреххлористый углерод (1:2)), хроматографию на оксиде алюминия. В результате получают кристаллический цианокобала- мин (98 % чистоты) с выходом 75 % его первоначального содержания в культуральной жидкости.

В России медицинские препараты в настоящее время получают с использованием мутантных штаммов Propionibacterium shermanii и Propionibacterium freudenreichen. Использование этих культур определяется способностью синтезировать более 10 000 мкг/л витамина В12. Культуру выращивают в анаэробных условиях в среде, содержащей глюкозу, кукурузный экстракт, сернокислый аммоний и соль кобальта. Образующиеся в процессе роста культуры кислоты нейтрализуют раствором NaOH, непрерывно поступающим в ферментер. Чтобы получить полные клинически активные формы корриноидов, через 72 ч ферментации, в среду вносят предшественник витамина В]2 — 5,6-ДМБ, включаемый бактериями в молекулу. Ферментацию заканчивают через 96—110 ч. Предшественник можно вносить и после окончания ферментации, даже в суспензию не растущих клеток, но только не в начале ферментации, поскольку кобаламин подавляет свой собственный синтез. По окончании брожения биомассу сепарируют, выделяют из нее витамин, экстрагируя его горячей подкисленной (до pH = 4,5/5,0) водой, содержащей стабилизатор (азотистокислый натрий или цианистый калий). Если получают аденозилкобаламин, то стабилизатор не добавляют, а экстракцию проводят в затемненном помещении или при красном свете. После экстракции витамина биомассу отделяют. Водный раствор витамина охлаждают, доводят pH до 6,8—7,0. Из раствора коагулируют белки, добавляя сернокислый алюминий и хлорное железо (III), и после фильтрации осуществляют очистку раствора витамина с использованием ионообменника СГ-1, для этого раствор витамина подкисляют до значения pH = 2,5/2,7 и наносят на последовательно соединенные колонны с сополимером СГ-1.

Сорбированный витамин элюируют раствором аммиака. В аммиачный раствор витамина вносят активированный уголь, десятикратный объем воды и 0,9 %-й цианистый натрий по отношению к массе угля. Массу 2 ч перемешивают, подкисляют соляной кислотой и после фильтрования и промывки угля витамин В12 десорбируют с угля изопропиловым спиртом. Изопропиловый спирт упаривают и витамин В12 подвергают дополнительно резорциновой очистке и кристаллизации. Себестоимость кристаллического препарата витамина В12 высокая из-за дорогостоящего сырья, применяемого как на стадии выращивания культуры, так и на стадии выделения витамина, из-за необходимости соблюдения стерильности и многостадийности выделения и очистки конечного продукта.

Кроме кристаллического препарата витамина В12 витаминная промышленность выпускает концентрат витамина В12, который включают как активную витаминную добавку в кормовые рационы сельскохозяйственных животных и птицы. Имеются также многочисленные сведения о том, что концентрат витамина В12 в ряде случаев положительнее влиял на состояние и рост животных, чем добавка чистого витамина В12.

Для производства концентрата кормового препарата витамина В12 в качестве углеродного сырья используют многокомпонентные органические субстраты, являющиеся отходами пищевых и микробиологических производств. Один из таких субстратов — спиртовая барда. Впервые спиртовую барду использовали для получения витамина В12 на Андру- шевском спиртовом заводе. Процесс проводили в анаэробных условиях в присутствии метанобразутощих бактерий. Согласно разработанной технологии, барду подогревают на пластинчатых теплообменниках до 60°С, используя тепло горячей послеспиртовой барды, направляемой на биосинтез кормовых дрожжей. Затем вторичную барду подают для сбраживания в железные метантенки. В сброжженной метановой бражке образуется в среднем 2 г/м3 витамина В12. Метановую бражку подкисляют соляной кислотой до pH = 5,5/6,0, дегазируют, сгущают до концентрации сухих веществ 35 % и сушат на распылительной сушилке [195]. В полученном продукте содержится 100 мг/кг витамина В]2. Каких-либо питательных добавок в питательную среду не вносят. При сбраживании метанобразующими бактериями последрожжевой барды образуется в среднем до 16 м3 на 1 м3 отходов с теплотворной способностью 6500 ккал/м3. Газы используют как топливо в котельной завода. Таким образом, технологическая схема получения витамина проста, используемое сырье дешево, отходы производства используются рационально, но содержание витамина В12 в готовом продукте ничтожно мало.

На рис. 6.1 показана аппаратурно-технологическая схема сгущения метановой бражки и получения биогаза. Последрожжевую барду из цеха сухих кормовых дрожжей подают в метантенк через теплообменники с температурой 53—55°С. Для поддержания постоянной температуры и перемешивания среды бражка подается насосом через подогреватель

4 из нижней части в верхнюю часть. Выделяющиеся в процессе брожения газы из метантенка поступают в газгольдер, а из него подаются в топку котла и на другие нужды. Метановая бражка из метантенка транспортируется в смеситель 6, куда из сборника 8 подается соляная кислота. В смесителе бражка доводится до pH = 5,5-Иэ,0 и насосом 7 перекачивается в подогреватель 9, где она нагревается до 100°С. Далее бражка подается в дегазатор, а оттуда насосом в подогреватели 12 и 13, где подогревается до температуры кипения в первом корпусе выпарной станции. Первый корпус выпарной станции и подогреватель 13 обогреваются свежим паром, а конденсат из них собирается в сборнике 21. Конденсат направляется в подогреватель 4, а из него в котельную. Вторичный пар первого корпуса, проходя ловушку 15, очищается от летучих веществ, подается на обогрев второго корпуса и подогревателя 12, а конденсат из них собирается в сборнике 20. Вторичный пар второго корпуса, проходя через ловушку, очищается, направляется на кипятильники брагоректификационной установки, в подогреватель 9, а из них поступает в сборник конденсата 19, куда идет через конден- сатоотводчик конденсат вторичного пара первого корпуса из сборника 20. Конденсат вторичных паров подается на обогрев барды в теплообменнике, а из него — на производство. Бражка упаривается на двухкорпусной выпарной станции под давлением с использованием вторичного пара. Выпарная станция оборудована аппаратами с принудительной циркуляцией и горизонтальными двухходовыми кипятильниками.

Описанная технологическая схема получения метанового газа и упаривания метановой бражки имеет универсальный характер и может быть использована в самых различных процессах метанового брожения. Недостатком установки является отсутствие очистки вторичных паров и конденсатов от летучих соединений (органических кислот, аммиака, высших спиртов, индола, скатола и т. п.), содержащихся в метановой бражке в зависимости от сбраживаемого сырья. При упаривании значительная часть этих соединений будет накапливаться во вторичных парах и конденсатах. Некоторые примеси, особенно дурно пахнущие, не позволяют возвращать пары и конденсаты в технологический цикл.

Спиртовая и ацетоно-бутиловая барды являются наиболее привлекательным отходом и сырьем для получения концентрата кормового препарата витамина В12 в Российской Федерации [172].

Для метанового сбраживания применяют декантат барды, в котором содержится 2—2,5 % сухих веществ, состоящих на 80 % из органических и на 20 % из неорганических веществ, и 97,8—98 % воды. Органические вещества состоят из белков, продуктов его гидролиза, несброженных сахаров, жирных кислот, в основном уксусной и масляной кислоты, жира, красящих и других экстрактивных веществ, в том числе и биологических активных веществ, например, рибофлавина в количестве 100 мкг/мл. В барде обнаружено 13 аминокислот, в том числе лейцин, валин, пролин, глутаминовая кислота и т. п. Таким образом, ацетонобутиловая барда является высоко питательной средой для жизнедеятельности микроорганизмов.

Рис. 6.1. Аппаратурно-технологическая схема сгущения метановой бражки и получения биомассы:

1 — теплообменник; 2 — метантенк; 3 — газгольдер; 4, 9, 12, 13 — подогреватель; 5, 7, 11, 18 — насос; 6 — смеситель; 8, 19—21

сборник; 10 — дегазатор; 14, 16 — ловушка; 15, 17 — выпарная установка

Продуцентами витамина является ассоциация микроорганизмов, которая представлена сапрофитными анаэробными бактериями, сбраживающими углеводы, аммонифицирующими бактериями родов Clostridium, Bacillus и др., ацетогенными бактериями родов Syntrophobacter, Desulfovibrio, сульфатвосстанавливающими и мета- нобразующими бактериями родов Mycobacterium, Pseudomonas, Methanobacterium. Процесс сбраживания осуществляют при оптимальном термофильном режиме брожения — при температуре 52—53°С.

Производство витамина В12 включает следующие стадии: непрерывное сбраживание отходов ацетонобутилового или спиртового производства биоценозом термофильных метанобразующих бактерий;

  • • стабилизацию метановой бражки;
  • • сгущение ее на выпарных аппаратах;
  • • сушку сгущенной массы на распылительных сушилках;
  • • выделение витамина В12 из сгущенной метановой бражки.

Принципиальная схема получения витамина В12 следующая.

Перед поступлением в ферментер декантат барды отделяют от взвешенных частиц в декантаторе. Поступающая на декантацию барда имеет температуру 100°С и практически стерильна. После декантатора барду охлаждают до 55—57°С. Брожение проводят в железобетонных ферментерах емкостью 4000 м3. Сбраживаемую среду (декантат барды с добавками, например, солями кобальта и метанолом) непрерывно подают в нижнюю часть ферментера. Отбор конечного продукта производят непрерывно в верхней части метанового ферментера.

В процессе брожения количество выделяемых газов составляет около 20 м3 на 1 м3 сбраживаемой среды. В состав газов входят метан (65 %), углекислота (30 %) и прочие газы (5 %). При брожении происходит повышение pH среды с 5 до 7,5—8,2. При этом содержание сухих веществ снижается, а аммиачного азота возрастает от 6,7 до 60 мг/м3.

Метановая бражка из ферментера поступает на выпаривание. Для предотвращения разрушения витамина В12 при тепловой обработке перед процессом выпаривания метановую бражку стабилизируют добавлением в нее 0,2—0,25 % сульфата натрия и 0,6—0,7 % соляной (или фосфорной) кислоты с доведением pH до 6,3—6,5. Перед подачей на выпарную установку метановую бражку дегазируют нагреванием при атмосферном давлении до 90—95°С. Процесс дегазации сопровождается сильным пенообразованием. Для гашения пены применяют кашалотовый жир.

Сгущение метановой бражки до содержания сухих веществ 20 % осуществляют в четырехкорпусных выпарных аппаратах при соблюдении температурного режима выпаривания по корпусам (табл. 6.34).

I корпус нагревают острым паром, II—IV — соковым паром от I— III корпусов соответственно. Сгущенную метановую бражку, имеющую pH = 5,8, высушивают до содержания сухих веществ 20 %. Сушку производят на распылительной сушилке, производительность которой 4,2 т испаряемой влаги в 1 ч. Сгущенная масса поступает на диск распылительного механизма, вращающегося со скоростью 10 680 об/мин. Теплоносителями служат газы брожения или природные газы, сжигаемые в печи сушилки. По пути в сушильную башню горючие газы смешивают с воздухом с доведением температуры их до 270—280°С, при этом температура в зоне сушки составляет 95°С, а разрежение — 25—30 мм вод. ст. Сухой концентрат осаждается в циклонах и расфасовывается в полиэтиленовые мешки, вложенные в крафт-пакеты.

Таблица 6.34

Температурный режим выпаривания метановой бражки

Корпус

Температура греющего пара, °С

Температура метановой бражки, °С

Содержание сухих веществ, %

I

143

135

2,2

II

132

119

4,7

III

116

103

7

IV

96

84

20

Количество синтезируемого витамина В12 в культуральной жидкости не превышает 500—600 мкг/л, в готовом продукте — 400—500 мг/кг, поэтому эффективность процесса невысока и выделение чистого витамина В12 из культуральной жидкости экономически неоправданно. Концентрат витамина В12 применяют только в кормовых рационах животных.

В то же время технология характеризуется простотой технологической схемы; дешевым сырьем; возможностью утилизации отходов спиртового производства; минимальными вторичными отходами.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >