Транскрипция. Синтез и созревание РНК

Транскрипция — синтез различных видов РНК на определенных участках ДНК. Это первый этап реализации генетической информации в клетке.

Транскрипция как процесс считывания информации с ДНК имеет ряд важных особенностей:

  • • информация считывается только с одной (главной или смысловой) нити ДНК в направлении от 3’- к 5’-концу нити ДНК;
  • • синтез РНК идет антипараллельно нити ДНК, т. е. в направлении от 5’- к З’-концу нити РНК по принципу комплементарности;
  • • синтез нити РНК осуществляется с помощью целого комплекса ферментов. Главными из них являются ДНК-зависимые РНК полимеразы I, II, III (далее в тексте РНК-полимеразы I, II, III);
  • • транскрипция — это очень энергоемкий процесс, на присоединение к синтезируемой нити РНК одного нуклеотида тратится одна молекула АТФ или ГТФ;
  • • участок ДНК, с которого считывается РНК и который ограничен с одной стороны промотором, а с другой — терминатором, называют транскриптационной единицей, или транскриптоном;
  • • транскрипция включает несколько этапов: инициация, элонгация (рост нити РНК), терминация и созревание (процессинг и сплайсинг) РНК;
  • • скорость транскрипции составляет 40—50 нуклеотидов в секунду у прокариот и около 60 нуклеотидов в секунду у эукариот;
  • • транскрипция возможна только на деконденсированном хроматине;
  • • у эукариот все процессы синтеза, процессинга и сплайсинга молекул РНК проходят в ядре.

Синтез РНК. Начало транскрипции (стадия инициации) зависит от наличия комплекса белков, называемых транскрипционными факторами и работой энхансеров. Эти белки связываются с блоком нуклеотидов ТАТА, входящим в состав промотора. Формируется сложный инициирующий комплекс. Только после этого РНК-полимераза II связывается с промотором и начинается синтез цепи преиРНК (рис. 5.9).

Начальные этапы транскрипции — роль энхансеров и транскрипционных факторов в инициации синтеза иРНК

Рис. 5.9. Начальные этапы транскрипции — роль энхансеров и транскрипционных факторов в инициации синтеза иРНК

В периоде роста (стадия элонгации транскрипции) молекула РНК-полимеразы II движется вдоль нити ДНК, добавляя нуклеотиды к З’-концу растущей нити РНК. Один ген может транскрибироваться несколькими РНК-полимеразами, двигающимися вдоль молекулы ДНК друг за другом. Образование на одном гене сразу нескольких молекул иРНК приводит к интенсификации белкового синтеза в клетке.

Транскрипция завершается, когда РНК-полимераза II доходит до конца гена и начинает считывать участок ДНК, называемый терминатором (стадия терминации транскрипции). Этот участок, размером в 10—35 нуклеотидов, состоит из повторяющихся последовательностей ААУАА. Пройдя этот участок, РНК-полимераза и синтезируемая молекула иРНК отделяются от нити ДНК. В результате формируется молекула первичного транскрипта — молекула преиРНК, которая содержит информацию, считанную со всего гена, как с экзонных, так и с интронных участков гена. Что же происходит дальше?

Молекуле иРНК необходимо выйти из ядра в цитоплазму, чтобы начался синтез белка. Но оказывается, молекула первичного транскрипта (преиРНК) еще не готова к этому. Она содержит участки, считанные с интронных участков гена и не несущие информацию о будущей белковой молекуле. Такая молекула не проходит через ядерные поры. Поэтому сразу после образования преиРНК с ней происходит ряд превращений, которые называют процессингом (созреванием) (рис. 5.10).

Рис. 5.10. Основные этапы синтеза молекулы иРНК:

Э1, Э2 — экзоны; И1, И2 — интроны; З-НТО, 5-НТО — нетранслируемые (регуляторные) участки молекулы иРНК; кэп — шапочка; полиА — полиадениловый конец молекулы; Ш—5 — виды мяРНК (малые ядерные РНК), входящие в состав сплайсосомы

Наиболее важным моментом созревания иРНК является процесс вырезания нетранслируемых (интронных) участков молекулы и дальнейшее сшивание транслируемых (экзонных) участков в зрелую молекулу иРНК. Это явление получило название сплайсинг (от англ. splising — сшивание). Как же происходит сплайсинг?

Сигнальными точками, в которых начинается вырезание участков РНК, служат короткие нуклеотидные последовательности (так называемые сплайт-гены), расположенные в конце интронных участков.

Эти участки распознаются малыми ядерными рибонуклеопроте- инами (snRNPs), которые состоят из молекулы малой ядерной РНК (мяРНК) и нескольких белков.

Несколько рибонуклеопротеинов объединяются в крупный комплекс — сплайсосому, которая вырезает интронные участки преиРНК и сшивает соседние экзонные участки. Самым интересным в работе сплайсосомы является тот факт, что мяРНК обладают каталитической ферментативной активностью (ранее считалось, что ферментами могут быть только белки). В результате образуется укороченная молекула зрелой иРНК, несущая информацию только о структуре белка.

За открытие и изучение процесса сплайсинга РНК Ричард Робертс и Филипп Шарп в 1993 г. были удостоены Нобелевской премии.

Каково биологическое значение сплайсинга? Как ранее было отмечено, ген может содержать большое количество экзонных и интронных участков. В процессе сплайсинга интронные участки удаляются, а экзонные участки иРНК становятся свободными и могут сшиваться в разной последовательности, хотя порядок следования экзонов не нарушается.

В некоторых молекулах иРНК в процессе сплайсинга могут быть удалены фрагменты, считанные даже с экзонных участков. В результате на одном гене гена может быть образовано несколько видов иРНК и, соответственно, в дальнейшем могут синтезироваться разные белки.

В качестве примера такого явления, получившего название — альтернативный сплайсинг, можно привести данные по гену Board- Complex у дрозофилы. Этот ген контролирует процесс превращения личинки в муху. Ген довольно крупный и содержит 120 тыс. пар нуклеотидов. В его структуре выделено 10 экзоных участков, разделенных интронными участками (рис. 5.11). Оказалось, что за счет комбинации экзонов, с одного гена может считыватся более 15 различных иРНК, кодирующих различные белки в клетках организма мухи — дрозофилы.

Открытие явления альтернативного сплайсинга позволило объяснить, как с 20—25 тыс. структурных генов нашего генома считывается более 100 тыс. белков. Недавно было выявлено, что у 95 % мультиэкзон- ных генов человека наблюдается альтернативный сплайсинг. Благодаря альтернативному сплайсингу, разнообразие белков в организме млекопитающих значительно выше, чем у низших животных, хотя количество генов у тех и других зачастую примерно одинаково.

Возможно, возникновение в эволюции сплайсинга и позволило организмам обходиться относительно небольшим количеством генов.

Помимо альтернативного сплайсинга, РНК может меняться с помощью молекулярного редактирования. Редактирование РНК — это процесс, в ходе которого информация, содержащаяся в молекуле РНК, изменяется путем химической модификации нуклеотидных оснований. В настоящее время установлена возможность редактирования тРНК, рРНК, иРНК эукариот. В результате редактирования преиРНК получаются разные молекулы иРНК, кодирующие, в итоге, разные белки. Редактирование РНК в клетках прокариот пока не описано.

Сложный сплайсинг молекулы преРНК у дрозофилы

Рис. 5.17. Сложный сплайсинг молекулы преРНК у дрозофилы:

1 — ген Broard-Complex у дрозофилы; 2 — интроны; 3 — экзоны; 4 — результаты альтернативного сплайсинга иРНК; мелкие цифры — номера экзонов

Строение иРНК. Структура и свойства иРНК различаются у про- и эукариот. Во-первых, у прокариот иРНК нестабильные и живут всего несколько минут. Они не подвергаются процессингу. Кроме того, в одной молекуле иРНК прокариот записана информация сразу о нескольких белках, и соответственно на одной рибосоме одновременно идет синтез нескольких белков. Общее количество иРНК в клетке бактерий составляет 1—2 % от общего количества РНК.

У эукариот иРНК стабильны и живут часы и сутки. От начала синтеза иРНК до ее выхода из ядра проходит около 10 мин. Одна молекула иРНК эукариот кодирует одну молекулу белка, и на одной рибосоме идет синтез только одной молекулы белка. Количество иРНК достигает 10—20 % от общего количества РНК.

Молекула иРНК эукариот имеет очень сложное строение. Начало синтеза белка происходит не с конца иРНК, а с так называемого инициирующего кодона АУТ. Но оказалось, что рибосома «узнает» первый кодон только в том случае, если за два нуклеотида до него находятся нуклеотиды А или Г, а после него обязательно следует нуклеотид Г. Таким образом можно записать возможную последовательность участка иРНК, где начинается считывание информации: ЦЦГЦЦАГЦЦАУГГАГУ

(инициирующий кодон подчеркнут, регулирующие нуклеотиды выделены жирным шрифтом).

В процессе созревания и вырезания интронов из молекулы преиРНК, к ней происходит присоединение ряда некодирующих белок последовательностей, присутствие которых является необходимым для дальнейшего существования иРНК и ее участия в синтезе белка.

Это так называемые нетранслируемые области (НТО), расположенные до старт-кодона и после стоп-кодона. Они называются 5’-нетранс- лируемая область (5’НТО) и З’-нетранслируемая область (З’НТО) соответственно. Нетранслируемые области участвуют в жизненном цикле иРНК, определяя ее стабильность, локализацию в клетке, время начала и интенсивность синтеза белка.

К 5’-НТО концу молекулы преиРНК присоединяется модифицированный фосфорными остатками гуаниновый нуклеотид, образуя — своеобразную «шапочку», или кэп. Она выполняет важные функции: защищает иРНК от действия ферментов и необходима для последующего транспорта иРНК из ядра в цитоплазму, а также участвует в регуляции сплайсинга и транскрипции.

К З’-НТО концу присоединяются от 30 до 200 адениновых нуклеотидов, образуя своеобразный поли-А хвост. Его функции сходны с функциями «шапочки». Кроме того, поли-А хвост определяет время жизни молекулы иРНК и служит сигналом для связывания с рибосомой.

Стабильность иРНК тоже закодирована в структуре молекулы на З’-конце. Специальные белки, связываясь с этими участками, продлевают время жизни молекулы иРНК, поэтому наиболее важные для клетки белки продолжают синтезироваться в большом количестве.

В результате формируется зрелая и довольно сложная по структуре молекула иРНК. Она перемещается из ядра в цитоплазму, где на рибосомах происходит синтез белка (трансляция).

Таким образом, молекулы иРНК содержат информацию не только о самом белке, но и о том, где, когда, с какой скоростью и в каком количестве этот белок будет синтезироваться в клетке.

Синтез остальных типов РНК: рибосомальных (рРНК), транспортных (тРНК), малых ядерных (мяРНК), происходит по той же схеме на соответствующих участках ДНК. Это гены так называемой второй (II) группы, которые не кодируют белки.

Некодирующие РНК. В последнее время в клетке было обнаружено множество молекул РНК, которые не кодируют белки (помимо транспортных и рибосомальных РНК). Число генов, которые кодируют эти РНК, составляет до 10 % генома и значительно превышает количество генов, кодирующих белки (3—5 % генома). Среди множества обнаруженных видов некодирующих РНК, наиболее интересными являются: микроРНК (mi-PHK), короткие интерферирующие РНК (si-PHK), малые ядерные РНК (sn-PHK), малые ядрышковые РНК (sno-PHK) и пи-РНК (piwi-PHK).

МикроРНК (mi-PHK) впервые были открыты у червя-нематоды Caenorhabditis elegans в 1993 г., а впоследствии обнаружены у многих других организмов — от бактерий до человека. Они представляют собой короткие (21—23 пары нуклеотидов) двуцепочечные молекулы РНК. Количество генов, кодирующих mi-PHK, достигает у человека 1000. Эти гены располагаются в разных участках ДНК, включая даже интронные участки других генов. Оказалось, что такие mi-PHK являются важнейшими регуляторами генной активности, способными вмешиваться в процессы транскрипции и трансляции как на уровне ДНК, так и на уровне иРНК. Полагают, что они регулируют активность до 30 % генов! Более того, один вид mi-PHK может регулировать работу более 100 генов. До последнего времени считалось, что микроРНК только подавляют работу генов и последующий синтез белков. Однако недавно оказалось, что действие микроРНК может меняться в зависимости от состояния клетки. В активно функционирующей или делящейся клетке микроРНК подавляет синтез белка. Однако состояние покоя или стресса приводит к противоположному эффекту — усилению синтеза белка.

Схема синтеза и работы микроРНК представлена на рис. 5.12. С гена, кодирующего микроРНК (1), считывается длинная двуцепочечная молекула предшественника микроРНК, которая поступает в цитоплазму (2). В цитоплазме к этой молекуле присоединяется ферментный комплекс Diser, который разрезает длинную молекулу на короткие (длиной в 20—23 нуклеотида) двуцепочечные молекулы РНК (3). Далее с молекулой mi-PHK (еще двуцепочечной) связывается другой белковый комплекс RISC СRNA-induced silencing complex), содержащий белок- фермент нуклеазу — Ago. Этот фермент «расшивает» двуцепочечную молекулу РНК. Одна нить распадается, а другая остается в составе комплекса RISC (4). Комплекс RISC и одноцепочечная mi-PHK комплементарно взаимодействуют с молекулой информационной РНК и далее происходит либо ее деградация (разрушение, 5), либо остановка трансляции (6).

МикроРНК оказались на удивление очень стабильными — время их полужизни составляет до 200 ч, тогда как обычные иРНК живут менее 10 ч. Это еще раз подчеркивает большое значение mi-PHK в метаболизме клетки. Таким образом, вмешиваясь в работу генома на разных этапах транскрипции или трансляции, mi-PHK выполняет множество функций в клетке: участвует в дифференцировке и развитии клеток и тканей, регулирует апоптоз, контролирует упаковку хроматина, влияет на развитие опухолей, контролируют работу иммунной и кроветворной систем и т. д.

Малые интерферирующие РНК (si-PHK). В 2006 г. американские ученые Эндрю Файер и Крейг Мелло получили Нобелевскую премию за открытие и изучение явления РНК-интерференции. Механизм РНК- интерференции заключается в разрушении молекулы иРНК короткими (21—23 нуклеотидов) комплементарными им молекулами РНК, названными малыми интерферирующими РНК (si-PHK). Si-PHK образуются из более длинных двуцепочечных РНК, источником которых могут быть: вирусы; введенные в клетку; искусственные генетические конструкции; транскипты мобильных генетических элементов (транспозо- нов). РНК-интерференция играет большую роль в развитии противовирусного и противоракового иммунитета, как у беспозвоночных, так и позвоночных животных. Механизм действия si-PHK сходен с механизмом работы mi-PHK (рис. 5.12), однако между самими некодирующими РНК обнаружился ряд существенных отличий (табл. 5.1).

Синтез и принцип действия микроРНК

Рис. 5.12. Синтез и принцип действия микроРНК

Таблица 5.1

Сравнение строения и функций разных видов некодирующих РНК

Виды РНК

Si-PHK

Mi-PHK

Piwi-PHK

Распространение

Эукариоты (растения, животные: позвоночные, беспозвоночные, одноклеточные)

Эукариоты (все царства), прокариоты

Эмбриональные клетки животных (начиная с кишечнополостных).

Нет у растений и простейших

Происхождение

Образуется из готовых транскриптов РНК (как своих, так и чужих)

Считывается с собственных генов

Считывается с собственных генов в эмбриональный период

Длина

21—23 нуклеотида

19—25 нуклеотидов

24—30 нуклеотидов

Виды РНК

Si-PHK

Mi-PHK

Piwi-PHK

Структура

Двуцепочечная, затем одноцепочечная

Двуцепочечная, затем одноцепочечная

Одноцепочечная

Процессинг

Фермент нуклеаза (diser) зависимая

Фермент нуклеаза (diser) зависимая

Фермент нуклеаза (diser) независимая

Эндонуклеазы

Ago2

Agol, Ago2

Ago3, Piwi, Aub

Активность

Деградация специфических комплементарных иРНК, метилирование геномной ДНК (перевод в состояние гетерохроматина)

Деградация или ингибирование трансляции множества и-РНК, ингибирование транкрипции на уровне ДНК

Деградация иРНК, кодирующих МГЭ* (транспозоны), регуляция транскрипции МГЭ*

Биологическая

функция

Антивирусная и иммунная защита, регуляция активности генов

Регуляция

активности

генов

Подавление активности МГЭ*

во время эмбриогенеза

Примечание. * Мобильные генетические элементы.

Открытие явления РНК-интерференции создало большие перспективы в изучении механизма работы генома, а также в разработке принципиально новых «генных» лекарств. Введение в клетку искусственно синтезированных молекул si-PHK позволяет целенаправленно «выключать» определенные гены, в том числе и гены, вызывающие серьезные заболевания. Чтобы установить роль отдельных генов в каком-нибудь процессе, проводят систематическое частичное выключение — «нокдаун» генов по очереди. Например, так были выявлены четыре гена, которые необходимы для перепрограммирования обычных клеток организма в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iSC/ iPSC, см. параграф 5.5).

Однако есть серьезные проблемы с использованием РНК-интер- ферирующих молекул в терапии. Они оказались нестабильными и быстро распадались после введения в кровь, а методы доставки молекул непосредственно в клетку еще несовершенны. Кроме того, оказалось, что РНК-препараты токсичны и вызывают побочные эффекты. Большинство препаратов были убраны из продажи. На сегодняшний день используют только препарат si-PHK против наследственной болезни мышечной системы — дистрофии Дюшена. Тем не менее отры- титие РНК-интерференции окрывает большие перспективы в биологии и медицине.

Пи-РНК (piwi-RNA, piwi-interaction RNA) — это еще один из множества видов малых некодирующих РНК. Они обнаружены у всех животных и представлены короткими (25—30 нуклеотидов) одноцепочечными молекулами (см. табл. 5.1). У растений пи-РНК пока не обнаружены. Закодированы пи-РНК в центромерных участках хромосом и считываются с обеих цепей хромосомной ДНК. Из-за большого содержания в молекулах piwi-PHK нуклеотида уридина они обозначаются так

как Ш, U2......Ш2. Синтезируются пи-РНК в огромном количестве,

но работают они только в период эмбриогенеза, когда борются с МГЭ (транспозонами), чья активность может нарушить структуру и работу генома. Нарушение синтеза пи-РНК может приводить к бесплодию и росту мутаций. Также предполагается участие пи-РНК в поддержании целостности теломер — важного участка хромосом, определяющего время жизни клеток.

Малые ядерные РНК (sn-PHK) — группа некодирующих РНК, ассоциированных с белками ядерного матрикса. Они образуют рибонукле- опротеиновые комплексы, входящие в состав сплайсосом и участвуют в синтезе иРНК.

Малые ядрышковые РНК (sno-PHK) имеют либо собственные гены в составе ДНК, либо закодированы в интронах других генов. Они участвуют в синтезе рибосомальных РНК и обнаружены во всех группах эукариот и бактерий-архей. Только у млекопитающих sno-PHK более 200.

Таким образом, становится ясно, что в клетке находится огромное количество разнообразных молекул РНК (десятки тысяч!) с самыми разнообразными функциями. Большая часть их кодируется в той части генома, которую долгое время считали «темной, мусорной, некодирующей». Однако выяснилось, что некодирующие РНК играют зачастую более важную роль, чем многие белки и ферменты. Фактически не только работа самих генов важна для функционирования и выживания клетки, но и регуляция их работы, осуществляемая, в том числе, «некодирующими РНК».

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >