Стволовые клетки. Классификация, свойства, применение

Выдающийся Российский ученый, генерал-майор медицинской службы, профессор Императорской Военно-медицинской академии А. А. Максимов (1874—1927) был одним из первых в мире, кто ввел понятие стволовая клетка — Stammzelle (ныне — stem cell).

Изучая процесс кроветворения, он предположил, что все клетки крови образуются в красном костном мозге из единой недифференцированной клетки (гемоцитобласт), которую он описал в своей статье «Лимфоцит как общая стволовая клетка разнообразных элементов крови в эмбриональном развитии и постфетальной жизни млекопитающих» (1900). Важность работ А. А. Максимова нельзя недооценивать: исследование обосновало существование как в эмбриогенезе, так и во взрослом организме, единой родоначальной клетки для форменных элементов крови. Работая в Чикаго (1922—1927), Александр Александрович суммировал свои многочисленные работы по изучению кроветворения и гистогенезу соединительной ткани в монографии Bindegewebeund blutbildendes Gewebe («Соединительная ткань и кроветворная ткань», 1928), вышедшей в виде отдельной главы многотомного руководства по гистологии. В ней А. А. Максимов обоснованно экстраполировал закономерности гистогенеза крови на соединительные ткани, предполагая наличие и в ней исходной единой — «стволовой мезенхимальной» клетки во взрослом организме.

В 1960-е гг. идеи А. А. Максимова были блестяще подтверждены в экспериментальных работах по кроветворению Александром Яковлевичем Фриденштейном (с сотрудниками). Он впервые выделил и изучил популяцию стромальных клеток-предшественников в костном мозге и лимфоидных органах, сформулировал понятие о стволовых стромальных клетках кроветворной и лимфоидной ткани.

В это же время были опубликованы результаты знаменитых опытов американских ученых Джеймса Тилла и Эрнеста Мак-Калаха, которые заключались в облучении мышей-реципиентов летальной дозой радиации, с дальнейшей трансплантацией костного мозга от животного- донора. Этим авторам удалось экспериментально и математически доказать, что кроветворение у облученных животных может быть восстановлено благодаря пересадке единственной клетки, которая, попав в благоприятное микроокружение (селезенку), могла дифференцироваться в разнообразные клетки крови.

Стволовая клетка — недифференцированная клетка, способная к самообновлению и дифференцировке в различных направлениях. Основными свойствами всех стволовых клеток являются:

  • • способность в норме длительное время находиться в покоящемся состоянии;
  • • способность поддерживать свою численность путем деления без перехода в дифференцировку. Эта уникальная способность позволяет обеспечивать постоянный запас небольшого количества стволовых клеток в течение почти всей жизни человека и животных;
  • • способность дифференцироваться в разнообразные специализированные типы клеток тканей и органов.

Классификация стволовых клеток. Исходя из разных свойств стволовых клеток, их классификацию можно вести по разным параметрам (признакам).

Классификация по потенциалу к дифференцировке:

  • • тотипотентные стволовые клетки способны дифференцироваться во все возможные типы клеток тканей и органов на любой стадии развития организма. К тотипотентным клеткам человека относят зиготу и клетки центральной клеточной массы бластоцисты;
  • • плюрипотентные стволовые клетки способны дифференцироваться во все возможные типы клеток тканей и органов, кроме клеток трофобласта (клетки наружного эпителия бластулы, из которого образуются плодные оболочки). К плюрипотентным клеткам относят эмбриональные стволовые клетки, а также индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC);
  • • мультипотентные стволовые клетки способны дифференцироваться в определенном направлении (в пределах определенного эмбрионального зародышевого листка или типа ткани). Примерами таких клеток являются гемопоэтические стволовые клетки и мезенхимальные стволовые клетки. Сюда же относят клетки, полученные из неонатальных тканей, например, из пуповинной крови или плаценты;
  • • олигопотентные стволовые клетки (их часто называют клет- ками-предшественниками) способны дифференцироваться в пределах нескольких типов специализированных клеток. Ярким примером олигопотентной стволовой клетки является общий лимфоидный предшественник (ОЛП). Из названия понятно, что ОЛП способен дифференцироваться в клетки лимфоидной ветки гемопоэза. В отличие от мультипотентной гемопоэтической стволовой клетки, которая способна стать любой клеткой крови, ОЛП не способен стать клеткой миелоидного ряда дифференцировки (сходная ситуация с общим мие- лоидным предшественником — он не может дать клетки лимфоидного ряда);
  • • унипотентные стволовые клетки, как правило, обладают очень высоким пролиферативным потенциалом, при этом способны дифференцироваться всего в один тип специализированных клеток. Примером унипотентных стволовых клеток являются сперматогонии или ооциты половых желез или миосателлиты мышечных волокон.

Классификация стволовых клеток (СК) по источнику развития:

• эмбриональные стволовые клетки (ЭСК, ESC) выделяют на ранней стадии зародышевого развития — из внутренней клеточной массы (ВКМ) бластоцисты. Бластоциста состоит из наружного слоя клеток, из которых в дальнейшем развивается плацента и производные зародышевых оболочек, и из ВКМ, которая дает начало всем тканям и органам плода. Зародыш достигает стадии бластоцисты на А—5 день эмбрионального развития и состоит примерно из 100—150 клеток (рис. 5.14).

Формирование бластоцисты в эмбриогенезе

Рис. 5.14. Формирование бластоцисты в эмбриогенезе

ЭСК являются плюрипотентными, т. е. способны дифференцироваться в клетки всех трех первичных зародышевых листков: эктодерму, мезодерму и энтодерму. Эмбриональные стволовые клетки можно выделить на основании наличия специфических мембранных маркеров-рецепторов: SSEF-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 и др. Кроме того, ЭСК характеризуются высокой активностью теломеразы и щелочной фосфатазы. Как и все виды стволовых клеток, ЭСК обладают способностью к самоподдержанию своей численности посредством симметричных или асиммертичных митозов. Контроль над этим свойством ЭСК осуществляет целая группа транскрипционных факторов, среди которых можно отметить Oct4 и Nanog. В случае низкой активности или блокировки этих факторов стволовые клетки начинают дифференцироваться и выходят из плюрипотентного состояния. Классическими факторами, используемыми при культивировании ЭСК in vitro, являются LIF (leukemia inhibitory factor), интерлейкин — IL6 и колонии стимулирующий фактор — SCF.

Существуют попытки применения ЭСК в клинической практике, однако по-прежнему большое количество вопросов остаются без ответа: иммунологические аспекты трансплантации, этические и правовые вопросы использования ЭСК, способы их хранения и консервации;

  • • фетальные стволовые клетки (ФСК) получают из абортивного материала после прерывания беременности или после выкидыша. Эти клетки уже встали на путь дифференцировки и, следовательно, каждая из них может пройти только ограниченное число делений. Наиболее изучены три типа ФСК: нейральные фетальные стволовые клетки, гематопоэтические фетальные стволовые клетки и фетальные клетки-предшественники, вырабатывающие инсулин. С точки зрения применения ФСК в терапевтических целях существует ряд сложностей, включающий этические и медицинские аспекты. Например, клетки, полученные из абортивного материала, часто обладают геномными изменениями и могут нести мутации, опасные для жизни реципиента. Таким образом, применение ФСК вызывает опасения и требует дальнейшего изучения;
  • • взрослые стволовые клетки (ВСК) находящиеся во всех тканях организма и способные дифференцироваться в пределах данной ткани. Естественно, что они подразделяются на ряд разновидностей:
    • а) гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) поддерживают образование всех типов клеток крови в процессе, называемом гемопоэзом, таким образом, основным местом расположения ГСК в нашем организме является красный костный мозг (КМ). Фенотип человеческих ГСК: CD34+, CD117hish, CD90low, CD133hish, Lin, CD38. Трансплантация ГСК позволяет воссоздать новую функциональную кроветворную систему и продукцию клеток крови у реципиентов. Это изначально было показано в исследованиях Тилла и МакКалаха на животных, а позднее блестяще подтверждено в клинических экспериментах Эдварда Доннелла Томаса в 1968 г. В 1990 г. он вместе с Джозефом Мюрреем получил Нобелевскую премию «за открытия, касающиеся трансплантации органов и клеток при лечении болезней». Трансплантация ГСК сейчас успешно используется в клиниках для лечения патологий, связанных с кроветворной системой (гематоонкология, анемии и другие заболевания). Источником ГСК для трансплантации являются либо собственные ГСК пациента (аутологичная трансплантация), либо ГСК от совместимого донора (аллотрансплантация). Для трансплантации используются ГСК, полученные из ККМ, а также из периферической или пуповинной крови. Получение ГСК из того или иного источника имеет свои плюсы и минусы. Забор ГСК из ККМ является трудоемким процессом и может нести угрозу здоровью донору, но, с другой стороны, он приводит к наибольшему выходу по количеству клеток. Низкое содержание ГСК в пуповинной крови порой требует трансплантации ГСК сразу от нескольких доноров, при этом такие ГСК наименее дифференцированы и подходят даже для реципиентов с низким индексом совместимости. Для ГСК, как и для многих типов стволовых клеток, характерно свойство хоуминга — способность мигрировать из периферического кровотока в соответствующее окружение — нишу. В настоящее время аутологичные трансплантаты имеют показатели выживаемости, превышающие 80 %, а показатель успеха для аллогенных трансплантатов колеблется от 30 до 70 % (через 5 лет). Количество пересаженных ГСК коррелирует с успешным приживлением и выживанием пациентов, т. е. для успешной трансплантации ГСК требуется большое количество стволовых клеток. К сожалению, существующие протоколы использования ГСК в клинике еще не эффективны и находятся на стадии постоянного совершенствования;
    • б) мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (MCK, MSC). Источниками МСК являются как взрослые ткани организма (красный костный мозг, периферическая кровь, жировая ткань), так и неонатальные источники (пуповинная кровь, плацента, плодные оболочки). Все они имеют мезенхимное (мезодермальное) происхождение. Они обладают меньшими, по сравнению с ЭСК, потенциями к дифференцировке в разных направлениях. Доказана их способность к дифференцировке в различных направлениях таких, как остеогенная (костная ткань), хондрогенная (хрящевая ткань), мышечная (включая кардиомиоциты), адипогенная (жировая ткань). Такая способность МСК является одним из важных путей клинического применения МСК. Интересны и другие направления дифференцировки МСК, включая нервную ткань, инсу- лин-продуцрующие клетки и т. д. Однако наиболее перспективной сферой клинического применения МСК является регенеративная медицина. МСК способны продуцировать широкий спектр регуляторных молекул, включающий в себя факторы роста G-CSF, GM-CSF, M-CSF, интерферон-у, цитокины семейства IL, факторы роста: FGF (1, 2, 8); IGF, VEGF, TGFp, хемокины (SDF-1, Mip-la) и т. д. Помимо того, что МСК обладают низкой иммуногенностью, снижая опасность отторжения транспланта, их использование позволяет избежать развития реакции «трансплантат против хозяина»;
    • в) стромальные (региональные) полипотентные стволовые клетки (ССК, SSC). Во всех органах и тканях взрослого организма животных и человека сохраняется популяция полипотентных стволовых клеток, которые способны поддерживать клеточный состав того или иного органа. Они могут дифференцироваться только в пределах клеточных типов данной ткани, сохраняя при этом способность к самообновлению. Безусловно, все типы региональных стволовых клеток интересны с точки зрения практического применения, однако всегда стоит взвешивать терапевтическую эффективность и сложность использования.

Базовой проблемой региональных СК является сложность их получения — например, нейрональные стволовые клетки располагаются в ткани полушарий головного мозга. Соответственно, их получение может привести к осложнениям, вплоть до угрозы жизни пациента (при аутологичной трансплантации) или донора (при аллогенной трансплантации). В условиях применения материала, полученного от донора, встает острый вопрос применения иммуносупрессивной терапии.

Таким образом, наиболее интересными с точки зрения терапевтического применения являются ЭСК, ГСК, МСК;

г) индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК, iPSC). Одним из современных генно-инженерных подходов получения плюрипотентных клеток явился способ перепрограммирования соматических клеток. При этом процессе происходит активация генов, активных в период эмбриогенеза, и одновременно блокируется активность генов, активных во взрослом состоянии. Это можно сделать несколькими способами, например, переносом ядра соматической дифференцированной клетки в неоплодотворенную яйцеклетку с предварительно удаленным ядром (рис. 5.15, а). Клетка с пересаженным ядром приобретает свойства эмбриональной стволовой клетки, и из нее может развиться любая ткань или целый организм. На этом основан принцип клонирования. Цитоплазма яйцеклетки каким-то образом перенастраивает ядро дифференцированной клетки, выключает в нем программы характерные для начальных стадий развития. Клетка приобретает свойства эмбриональной стволовой клетки за счет присутствия в цитоплазме яйцеклетки факторов ранних этапов развития организма. Из такой клетки может развиться любая ткань или целый организм. Как только появилась техническая возможность, ученые начали манипулировать с яйцеклетками млекопитающих и в 1996 г. на свет появилась знаменитая овечка Долли. Сегодня клонированы представители около двадцати видов позвоночных животных.

Вероятность получения клона для всех изученных видов достаточно низка (не более 10 %). Основным итогом этих экспериментов стал вывод о том, что в ядре любой взрослой соматической клетки сохраняются факторы плюрипотентности и, теоретически, из нее могут развиваться любые другие клетки: нужно только активировать соответствующие гены. В медицине это открыло бы путь к заместительной клеточной терапии — терапевтическому клонированию клеток и получению пациент-специфических стволовых клеток, способных дифференцироваться в любую пораженную ткань.

Другой вариант — активация «генов плюрипотентности», которые запускают процесс репрограммирования взрослой соматической клетки до состояния эмбриональной стволовой клетки (рис. 66, б). В 2006 г. научной группой профессора С. Яманака был проведен анализ влияния 24 факторов, тем или иным образом вовлеченных в процессы становления и поддержания плюрипотентности. Используя ретровирусную трансфекцию, авторы произвели трансформацию мышиных фибробластов кожи различными комбинациями данных факторов. Было установлено, что использование комбинации всего четырех факторов — Oct4, Sox2, с-Мус, Klf4, необходимо и достаточно для индукции плюрипотентного состояния в мышиных фибробластах.

Принципиальная схема опытов Д. Гёрдона по клонированию (а) и С. Яманака получению индуцированных плюрипотентных стволовых

Рис. 5.15. Принципиальная схема опытов Д. Гёрдона по клонированию (а) и С. Яманака получению индуцированных плюрипотентных стволовых

клеток (б)

Сам процесс репрограммирования клеток проходит несколько стадий и пока не очень эффективен. Только 1 % клеток, вступивших на путь репрограммирования, доходят до этапа стабилизации и обладают свойствами плюрипотенции. За время, прошедшее с момента этого открытия, были получены новые интересные данные. Выяснилось, что для репрограммирования достаточно даже двух ключевых факторов (Oct4, Sox2) из четырех. В 2012 г. английский исследователь Д. Гёрдон и его ученик С. Яманака были удостоены Нобелевской премии.

Процесс получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток связан с рядом сложностей, таких как выбор объекта и генов для репрограммирования, а также клеточного источника для данного процесса — клетка с большим пролиферативным потенциалом с большей вероятностью перевоплотится в иПСК в сравнении с клеткой, которая делится редко. Несмотря на сложности и ряд нерешенных проблем, репрограммирование клеток и получение популяции ИПСК/iPSC- клеток открывает широкие возможности их использования в тканезаместительной терапии и регенеративной медицине. На данный момент целый ряд соматических клеток был репрограммирован. Удалось получить ИПСКАРБС-клетки из нервных клеток, клеток эпидермиса, В-лимфоцитов, моноцитов крови, (3-клеток поджелудочной железы.

Создаются банки индуцированных стволовых клеток. Это даст возможность использовать собственные клетки пациента для регенерации тканей и органов; избежать иммунологических проблем; снять этические и правовые вопросы; решить вопрос об источнике пула стволовых клеток. Самое главное — это путь к лечению целого ряда заболеваний человека, в том числе и наследственных, хотя для полноценного использования iSC/iPSC в практике еще далеко.

В настоящее время появилась возможность прямого репрограммирования одного типа соматических клеток в другой, минуя стадию индукции плюрипотентрости и образования ИПСК. Прямое репрограммирование возможно как среди производных одного зародышевого листка, так и разных.

В 2016 г. подписан Федеральный закон № 180-ФЗ от 23.06.2016 «О биомедицинских клеточных продуктах», который открывает перспективы использования клеточных технологий для научных и медицинских целей. Появление такого закона свидетельствует о готовности государства признать важность исследований клеточных препаратов, что, безусловно, будет способствовать нарастанию темпов получения новых данных о безопасности и эффективности применения стволовых клеток в медицине;

  • • клетка находится в фазе G0, но в течение этого времени приобретает ряд специфических черт строения, связанных с ее функционированием, — клетка дифференцируется. При необходимости (например, при повреждении органа) она может вступить в новый клеточный цикл. В отличие от стволовых клеток — такие клетки дифференцируются только в определенном направлении;
  • • клетка находится в фазе G0, при этом дифференцируется и необратимо теряет способность к делению. По мере старения организма резко увеличивается вероятность перехода клеток в стадию G0 — большинство клеток (в том числе и стволовые) утрачивают способность к делению. Как оказалось, это связано с тем, что число делений клетки генетически запрограммировано. После «выработки» своего ресурса клетки переходит в стадию G0 и, пробыв некоторое время в состоянии покоя, стареют и погибают. Такие клетки получили наименование терминально дифференцированных клетках. Они есть в составе любой ткани.

Таким образом, интерфаза как важная часть жизненного цикла клеток представляет собой сложнейший процесс, регулируемый множеством как внешних, так и внутренних факторов.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >