Репликация ДНК в эу- и прокариотических клетках

После того, как мы познакомились с основными периодами интерфазы в жизненном цикле клеток, необходимо более подробно разобрать процесс репликации ДНК в эу- и прокариотических клетках, проходящий в синтетическом (S) периоде интерфазы.

Репликация — процесс самовоспроизведения молекул нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) с целью обеспечения точного копирования наследственного материала клеток организма и передачу его последующим поколениям.

Этапы репликации. Основные сведения о молекулярных основах репликации получены при изучении репликации ДНК бактерии кишечной палочки Е. coli. Оказалось, что, несмотря на имеющиеся различия в организации генома про- и эукариот, основные процессы и механизмы репликации у этих организмов сходны.

Репликация включает в себя несколько этапов, каждый из которых контролируется и направляется целым комплексом специальных белков-ферментов (рис. 5.16).

Репликация ДНК в синтетический период клеточного цикла

Рис. 5.16. Репликация ДНК в синтетический период клеточного цикла

у эукариот:

А — начальные этапы; Б — продолжение репликации: 1 — материанская двойная нить ДНК; 2 — топоизомераза; 3 — хеликаза; 4 — стабилизационные белки (SSB); 5 —ДНК-полимераза; 6 — праймаза; 7 — РНК-праймер (затравка);

8 — синтез запаздывающей цепи ДНК (фрагментов Оказаки); 9 — синтез основной (лидирующей) цепи ДНК; стрелки — направления синтеза новых цепей ДНК и всего процесса репликации

Для начала репликации необходимо деспирализовать хроматин и «расплести» двойную спираль ДНК. Деспирализацию хроматина проводят специальные гистонные белки (см. параграф 5.1). Затем двойную цепь ДНК «расплетают» специальные белки-ферменты топоизомеразы и хеликазы. Топоизомераза раскручивает спираль ДНК и образуется участок — «пузырь», где две соседние цепи ДНК разъединены. На каждом конце такого «пузыря» образуется точка начала репликации — репликативная вилка. Участок ДНК, где начинается и идет репликация называется — репликон.

На расплетенных нитях «родительской» ДНК в соответствии с законом комплементарности начинают синтезироваться «дочерние» нити, подчиняясь закону комплементарности пар нуклеотидов. В настоящее время доказана схема полуконсервативного синтеза ДНК. По этой схеме на каждой из расплетенных цепей ДНК достраивается новая цепь (рис. 5.17). Процесс синтеза новых цепей ДНК осуществляет сложным комплекс белков и ферментов, получивший название реплисома. Он состоит из: короткой молекулы РНК-праймера (затравки), запускающей синтез новой цепи фермента — праймазы, синтезирующей РНК-праймеры; фермента ДНК-полимеразы, соединяющего нуклеотиды в цепь.

Скорость синтеза ДНК составляет: у эукариот — 100—400 пар нуклеотидов в секунду; у прокариот значительно выше — около 3000 пар нуклеотидов в секунду.

Следующим этапом синтеза ДНК является «проверка» правильности синтеза новой цепи ДНК. Это делают также ферменты ДНК-полимеразы I и III. Это чрезвычайно важная работа, ведь каждая «ошибка» — это мутация, последствия которой предсказать невозможно. Механизм исправления ошибок заключается в вырезании поврежденного участка синтезируемой нити ДНК ферментами — нуклеазами и последующем восстановлении пробела с помощью ДНК-полимераз. Точность репликации очень высокая, ошибки встречаются реже, чем одна на 1 млн пар нуклеотидов.

Синтез новых цепей ДНК идет одновременно с двух «материнских» цепей антипараллельно, в направлении 5' конца к 3' концу. По одной нити ДНК, называемой главной, или ведущей, синтез идет непрерывно. По другой — антипараллельной, называемой запаздывающей или ведомой, синтез новой цепи ДНК идет отдельными фрагментами, каждый из которых запускается своим РНК-праймером. Эти фрагменты получили наименование по имени японского биолога — «фрагменты Оказаки». По мере синтеза фрагментов они сшиваются специальным ферментом — ДНК-лигазой в непрерывную цепь ДНК. Однонитевые участки ДНК в процессе репликации покрываются специальными стабилизирующими белками (SSB).

Репликация ДНК должна вовремя остановиться. Ферменты ДНК — полимеразы только добавляют в растущую цепь нуклеотиды и проверяют их правильное расположение. Кто же останавливает репликацию?

Полуконсервативный способ репликации ДНК

Рис. 5.17. Полуконсервативный способ репликации ДНК:

1 — материанская нить ДНК; 2 — вновь синтезированные (дочерние) нити ДНК

У прокариот ДНК кольцевая, т. е. не имеет конца, и синтез завершается, когда две репликативные вилки встречаются друг с другом. У эукариот эта проблема решается более сложным путем.

Теломеры. Еще в 1971 г. советский ученый Алексей Матвеевич Оловников предположил, что при репликации ДНК фермент ДНК- полимераза не может полностью скопировать всю молекулу ДНК и на ее концах остается нескопированный фрагмент — теломер.

Теломеры как концевые участки хромосом были открыты еще в 1938 г. лауреатами Нобелевской премии генетиками Б. Мак-Клинток и Г. Мёллером, однако тогда роль теломеров была неизвестна. Каждая хромосома имеет два теломера на концах. В клетках человека теломеры представлены фрагментом ДНК и состоят из несколько тысяч повторяющихся единиц последовательностей — (ТТАГГГ)п. Эти последовательности с высоким содержанием гуанина стабилизируют концы хромосом. Теломерные повторы — весьма консервативные последовательности. Повторы большинства позвоночных (включая человека) состоят из нуклеотидов (TTAGGG) п, повторы насекомых — (TTAGG)n, теломеры большинства растений — (TTTAGGG)n (табл. 5.5).

Таблица 5.5

Теломерные повторы в хромосомах разных организмов

Таксон

Вид

Последовательность нуклеотидов 5'—» 3'

Простейшие

Euplotes

TTTTGGGG

Слизневые грибы

Phusarum

TTTAGGG

Жгутиковые

Trypanosoma

TTAGGG

Споровики

Plasmodium

TT(T/C)AGGG

Грибы

Neurospora Candida maltosa

TTAGGG

ACGGATGGAGACTCGCTTGGT

Нематоды

Ascaris

TTAGGC

Насекомые

Bombus mori

TTAGG

Водоросли

Chlamidomonas

TTTTAGGG

Высшие растения

Arabidopsis

TTTAGGG

Позвоночные

животные

Homo sapiens

TTAGGG

В начале 1960-х гг. американский ученый Л. Хайфлик обнаружил, что клетки организма животных и человека способны делиться ограниченное количество раз. Для большинства тканей человека этот предел (лимит — Хайфлика) составляет примрно 50—70 делений, однако причина этого явления была долгое время непонятна. Было установлено, что теломеры клеток укорачиваются на 50—60 нуклеотидных звеньев при каждом клеточном делении. Предположили, что поскольку теломерная ДНК на концах хромосом имеет форму петли, то при достижении определенной длины образование кольца становится невозможным, и это воспринимается клеткой как повреждение и деление останавливается.

Когда длина теломер в клетке достигает еще более критического уровня (менее 2kb), наступает резкое изменение метаболизма клетки, в том числе происходит нарушение репликации ДНК и запускается механизм апоптоза, за которым следует гибель клетки.

Получалось, что хромосомы должны укорачиваться при каждом делении клетки за счет некопируемых концевых участков теломер. Оловников А. М. придумал, как эта проблема может решаться у эукариот, и выдвинул гипотезу о существовании специального фермента — теломеразы, способной добавлять к концу хромосомы недостающие повторяющиеся последовательности. Он также предположил, что регуляция работы этого фермента может играть ключевую роль в старении организма за счет «выключения» теломеразы и постепенного укорачивания концевых участков хромосом у клеток, которые в результате делятся лишь ограниченное число раз и стареют.

Неполадки в механизме такой регуляции могут быть причиной бесконтрольного деления клеток, что характерно для злокачественных опухолей (рака), которые отличаются достаточно высокой активностью теломеразы, которая и поддерживает длину теломер на постоянном уровне. К сожалению, теломеразная активность даже растет по мере роста опухоли. Кроме раковых клеток, теломераза активна в клетках эмбриональных тканей, способствует нормальному росту организма и формированию зрелых тканей и органов. Во взрослом организме теломераза не активна.

Теломераза состоит из РНК и белков. РНК-компонент теломеразы содержит короткий фрагмент (праймер), который служит матрицей для синтеза теломерной ДНК. По сути, теломераза является ферментом, сходным с обратной транскриптазой, поскольку РНК-теломераза является матрицей для синтеза недостающего фрагмента ДНК. Необходимо отметить, что теломераза активирует синтез лишь небольшого хвостового участка теломера, утрачиваемый вследствие концевой репликации. Основная же часть теломерной ДНК реплицируется путем обычного синтеза ведущей и отстающей цепей ДНК с помощью обычных ДНК-полимераз.

Теломерная теория во многом объяснила механизм роста и старения клеток и организма, открыла перспективы для лечения ряда болезней (особенно рака).

Выяснилось, что на состояние теломер оказывают влияние и внешние факторы (стресс, болезни). Исследование ДНК детей, которые подвергались в детстве сильному стрессу (физическое насилие), показало, что у них теломеры короче, чем у контрольной группы. Клетки с короткими теломерами становятся генетически нестабильными, предрасположены к злокачественному росту и раньше стареют.

Однако с течением времени стали накапливаться данные, которые не укладывались в теломерную теорию старения организмов. Так, при сравнении диких и лабораторных мышей выяснилось, что длина теломер у них резко различается: у лабораторных мышей она в 10 раз длиннее. Согласно теории, жить они должны дольше, чем их дикие сородичи, а оказалось, что живут они тот же срок. У ряда организмов (дрозофилы) вообще нет теломеразы, а в концы ее хромосом встроены мобильные генетические элементы, предотвращающие ее укорочение.

Тем не менее теломеры играют важную роль в метаболизме клеток и работе ядерного аппарата клетки:

  • • теломеры поддерживают целостность хромосом;
  • • обеспечивают точную репликацию хромосом;
  • • участвуют в мейотическом спаривании хромосомом, мейотиче- ской и митотической сегрегации хромосом и в организации ядра;
  • • ответственны за прикрепление хромосом к ядерному матриксу;
  • • защищают концы ДНК от деградации эндонуклеазами и предотвращают активацию системы репарации.

Одновременно с процессом репликации ДНК в синтетическом периоде идет интенсивный синтез ядерных белков — гистонов, которые соединяются с вновь синтезируемыми нитями ДНК и формируют нормальную нуклеосомную структуру ДНК.

Особенности процесса репликации у прокариот:

  • 1) прокариоты имеют одну кольцевую молекулу ДНК, т. е. одну хромосому. В зависимости от условий, нуклеоид бактериальной клетки может состоять из одной или нескольких копий одной и той же хромосомы. Так, у Azotobacter chroococcum в фазе роста на одну клетку приходится 20—25 копий хромосомы, у Desulfovibrio gigas — 9—17 копий хромосомы;
  • 2) репликация ДНК у бактерий начинается со строго фиксированного сайта на хромосоме — oriC. Он включает в себя участки с так называемыми ДНК-боксами (DnaA-боксами) и расположенными между ними короткими последовательностями. OriC содержит сайты связывания белков, изгибающих ДНК — IHF (integration host factor) и FIS (factor for inversion stimulation) и помогающие белку — инициатору DnaA раскручивать ДНК. Белок DnaA играет ключевую роль в сборке репли- сомы — многокомпонентного белкового комплекса, осуществляющего двунаправленный синтез ДНК. Белок распознает область начала репликации и привлекает к месту сборки остальные белковые компоненты реплисомы. Репликация имеет, как у эукариот, полуконсервативный характер, идет одновременно в двух направлениях и заканчивается в строго фиксированной точке на хромосоме;
  • 3) ключевой фермент репликации у прокариот — ДНК-полиме- раза III, работающая в комплексе с более чем двадцатью белками. Она катализирует синтез как ведущей, так и ведомой нити ДНК (табл. 5.6);

Таблица 5.6

Сравнение репликативных и транскрипционных комплексов архей, бактерий и эукариот

Признак, свойства

Архебактерии

Эубактерии

Эукариоты

ДНК зависимая ДНК-полимераза

Тип В

Тип С

3 ДНК-полимеразы (а, е, 5) Тип В

Начало репликации

Ori-ORC

Ori-ДпаА

Or- ORC

Нуклеосомы

+

+

ДНК-хеликаза

Dna2 (3'—5')

DnaB (3— 5')

Dna2 (3—5')

Топоизомеразы

Торо IA, Торо ПА, Торо VI/B

Торо IA, Торо ПА

TopoIIB

ДНК-зависимая

РНК-полимераза

6—14 субъединиц

4 субъедтиницы

15 субъединиц

Промотор

ТАТА-бокс

Бокс Приблова

ТАТА -бокс

Транскипционные

факторы

TFB, TFIIB, ТВР

Нет

TFIIB, ТВР

Активаторы и репрессоры

Прокариотические

Прокариотические

Эукариотические

  • 4) репликация начинается в одной точке и распространяется на всю хромосому. Образуется один репликон (в отличие от эукариот, где репликация может проходить в нескольких точках хромосомы). Способ репликации у прокариот получил название унирепликонный, в отличие от полирепликонного способа у эукариот;
  • 5) репликация ДНК у прокариот идет значительней быстрее, чем у эукариот. У бактерий она составляет порядка 100 000 пар нуклеотидов в минуту, у эукариот — 500—5000 пар в минуту.
 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >