Типовые приемы и методы подготовки биообъектов

Главным объектом, центром биотехнологического процесса является клетка. Именно в ней синтезируется целевой продукт. Клетка работает с огромной производительностью по конкретной заданной программе и синтезирует сложнейшие соединения, в первую очередь белки.

Независимо от природы объекта — клетки или ткани — на начальном этапе разработки получают чистую культуру клеток или тканей. Все дальнейшие манипуляции представляют собой единообразные классические методы микробиологии.

Выбор микроорганизмов

В настоящее время известно около 100 тыс. различных м.о. Поэтому правильный выбор продуцента конкретного вещества (витамин В12, треонин, эритромицин или метан) - непростая задача.

Первый путь: вначале проводится выделение м.о. — путем отбора проб из тех мест, где их обитание наиболее вероятно.

Углеводородокисляющие м.о. можно найти возле бензоколонок, целлюлозоразлагающие и метанобразующие — в рубце жвачных животных. Пробы вносят в жидкие питательные среды, называемые элективными. В них путем варьирования разных факторов создаются условия развития нужного продуцента: источники энергии, углерода, азота, значения pH, температуры, осмотическое давление и т. д. Если требуется получить холестериноксидазу, то единственным источником углерода в питательной среде должен быть холестерин, для углеводоро- докисляющих — среды с парафином, для продуцентов липолитических ферментов — липиды и т. д. Таким образом получают накопительные культуры м.о.

После этого выделяют чистые культуры. Для этого используют плотные питательные среды, на которые засевают образцы проб из накопительных культур.

На плотных питательных средах отдельные клетки м.о. образуют изолированные колонии. При последующем пересеве получаются чистые культуры продуцента, которые состоят из популяций клеток одного вида.

Второй путь: подбор из имеющихся коллекций м.о. При этом пользуются имеющимся опытом: продуцентов антибиотиков находят среды актиномицетов; внеклеточные ферменты получают из грамположительных бактерий и т. д.

Кроме важнейшего свойства продуцировать заданное вещество м.о. должны удовлетворять следующим требованиям:

  • • обладать высокой скоростью роста,
  • • использовать недорогие субстраты,
  • • быть устойчивыми к заражению посторонней микрофлорой.

Все одноклеточные м.о. характеризуются высокой скоростью синтеза: корова массой 500 кг в сутки синтезирует 0,5 кг белка. Столько же можно получить с помощью 5 г дрожжей.

Есть только один вид малоизученных олиготрофных микроорганизмов, которые растут очень медленно. Но они представляют интерес как продуценты различных веществ.

Очень перспективными м.о. являются фотосинтезирующие — фототрофы. Они восстанавливают С02 и окисляют воду (цианобактерии и эукариоты) и способны усваивать атмосферный азот.

С помощью этих м.о. можно получать аммиак, водород, белки и различные биопрепараты. С применением методов генной инженерии в перспективе на основе фототрофов можно создать технологии биоконверсии солнечной энергии.

Выгодным объектом являются также термофильные м.о. Они растут при температуре 60—80°С, а некоторые — до 110°С и выше. Их можно найти в горячих выбросах сверхгорячих вод на больших океанических глубинах. При культивировании таких м.о. нет опасности развития посторонней микрофлоры. Термофилы могут продуцировать спирты, аминокислоты, ферменты, молекулярный Н2. Дополнительно снижаются затраты на стерилизацию оборудования. Эти м.о. обладают высокой скоростью роста и синтеза продуктов. Получаемые ферменты также устойчивы к высокой температуре, но неактивны при 20—45°С. Низкие температуры оптимальной активности ферментов характерны для мезофилов.

Ферменты, синтезированные термофилами, устойчивы не только к нагреванию, но и к действию окислителей, детергентов, органических растворителей и др. Активность протеазы Thermus caldophilus при 20°С почти в 100 раз ниже, чем при 75°С.

Еще одно преимущество связано с затратами на охлаждение биореакторов. Большой перепад температур между рабочим пространством ферментера и теплоносителем в системе охлаждения способствует лучшей теплоотдаче. Это упрощает конструкцию, снижает габариты установки в целом при сохранении ее производительности. Упрощается обслуживание ферментера, организация барботажа, пеногашения и перемешивания.

Селекция

Селекция — это направленный отбор мутантов, т. е. организмов, у которых наследственность претерпела скачкообразное изменение. Эти изменения являются следствием структурной модификации последовательности нуклеотидов в ДНК.

Методика селекции развивается в направлении от слепого отбора к направленному конструированию геномов.

Тем не менее метод спонтанных мутаций сыграл большую роль: были отобраны для культивации производительные штаммы пивных и винных дрожжей, пекарских дрожжей, а также уксуснокислых, пропионовокислых бактерий и др.

Отбор проводится ступенчато: на каждом этапе выбираются самые высокопродуктивные клоны. Мутации происходят редко: одна происходит после того как ген удвоится ~106—108 раз. Таким образом, метод можно усовершенствовать.

Высокие плотности популяции ~109 клеток в 1 мл суспензии в большом объеме при непрерывном культивировании позволяет получить достаточное количество мутантов.

Разработан метод повышения устойчивости м.о. к самым различным факторам — кислотам, щелочам, ионам тяжелых металлов и др. Метод заключается в непрерывной подаче ингибирующего фактора в биореактор в процессе культивирования. При этом получаются резистентные мутанты в концентрации до 10 %.

Увеличения числа мутаций можно добиться методом индуцированного мутагенеза. Он заключается в искусственном повреждении генов с помощью ультрафиолетового рентгеновского и у-излучения, а также некоторых химических соединений — азотистой кислоты, алкилирующих веществ (этилме- тансульфонат, нитрозамины), некоторые красители и др.

После проведения мутагенной обработки, делают проверку (скрининг) полученных клонов и отбирают самые продуктивные. Затем процедуру повторяют ступенчато.

Этот метод очень трудоемок, процесс ведется вслепую, по конечному результату. Знание характера мутации позволяет усовершенствовать методику.

Рассмотрим сущность понятия «характер мутации».

В конкретном примере получения штаммов, устойчивых к тяжелым металлам, возможны такие виды мутации:

  • • подавление системы поглощения катионов металлов бактериальной клеткой;
  • • активация выброса поглощенных катионов из клетки;
  • • перестройка систем, чувствительных к ингибирующему действию тяжелых металлов.

Теоретическая база направленной селекции была разработана в рамках молекулярной генетики.

Молекулярная генетика явилась базой разработки методов отбора по устойчивости продуцента к структурным аналогам продукта.

Классификация микробиологических продуктов

Имеющие практическое значение продукты жизнедеятельности клеток очень разнообразны.

  • 1. Целевым продуктом могут быть клетки. Их используют как биомассу для получения кормового белка.
  • 2. Клетки микроорганизмов, особенно в иммобилизованном состоянии могут служить катализаторами процессов биотрансформации. Так называются реакции превращения исходных соединений (предшественников) в целевой продукт с помощью клеток живых организмов либо ферментов, выделенных из них (аминокислоты, антибиотики, стероиды и др.).
  • 3. Продуктами могут быть макромолекулярные соединения — белки, ферменты, полисахариды, полиэфиры, выделенные из культивированных м.о. и тканей.
  • 4. Низкомолекулярные продукты метаболизма, выделенные в субстрат. Они делятся на первичные и вторичные. Первичные необходимы для роста и развития клеток — аминокислоты, нуклеотиды, моносахариды, витамины, коферменты и др.

Вторичные метаболиты не требуются для выживания и образуются по завершении фазы роста (рис. 2.2).

Динамика изменения биомассы и образования первичных (А) и вторичных (Б) метаболитов в процессе роста

Рис. 2.2. Динамика изменения биомассы и образования первичных (А) и вторичных (Б) метаболитов в процессе роста

организма:

1 — биомасса; 2 — продукт

Регулирование клеточного метаболизма

Принцип обратной связи. В 1984 г. В. Г. Дебабов сформулировал экмпериментально установленный принцип обратной связи для регуляции деятельности ферментов в биосинтезе, как конечных, так и промежуточных продуктов метаболизма. Согласно этому принципу повышение концентрации какого- либо метаболита может иметь два последствия:

  • 1) ингибирование активности энзима, который участвует в синтезе метаболита;
  • 2) репрессия синтеза этого энзима (он перестает синтезироваться).

Схема принципа обратной связи для синтеза конечного продукта метаболизма показана на рис. 2.3.

Схема негативной регуляции биосинтетического пути конечным продуктом

Рис. 2.3. Схема негативной регуляции биосинтетического пути конечным продуктом:

А, В, С, D — продукты реакций, катализируемых энзимами ЕА, Ев, Ес, Е0.

Так, при наличии глюкозы и ионов NH| клетки синтезируют все необходимые азотосодержащие вещества. Однако если добавить в субстрат какую-либо аминокислоту, то синтез этой кислоты быстро прекращается в результате ингибирующего действия продукта.

Одновременно клетки нуждаются в целевом продукте. Поэтому желаемый эффект можно получить с применением аналогов конечного продукта.

Добавление в субстрат структурного аналога метаболита вызывает такой же эффект, как и повышение концентрации метаболита. Такой аналог не может заменить метаболит, например, войти в состав белка. Поэтому рост нормальных клеток подавляется из-за голода по целевому продукту.

Некоторые конечные метаболиты и их аналоги:

L-аргинин D-аргинин

L-гистидин L-тиазолаланин

L-лейцин L-валин

L-триптофан 5-метилтриптофан

В обоих способах (повышение концентрации метаболита и добавление структурного аналога) выживают лишь некоторые мутанты с нарушенной регуляцией активности и синтеза фермента.

Для получения сверхпродуцентов, которые синтезируют продукт в аномально высокой концентрации, нужны мутанты со следующими свойствами:

  • 1) энзим ЕА сохранил функциональную активность, но потерял по каким-либо причинам чувствительность к ингибирующему действию конечного продукта или его аналога;
  • 2) синтез энзима ЕА устойчив к избытку продукта или его аналога.

Если требуется накапливать не конечный, а промежуточный продукт биосинтеза (см. рис. 2.2), то блокируется этап синтеза, следующий за интермедиатом. Схема блокирования показана на рис. 2.4.

Схема блокирования промежуточной реакции биосинтетического пути с целью получения сверхпродуцента

Рис. 2.4. Схема блокирования промежуточной реакции биосинтетического пути с целью получения сверхпродуцента

Такой мутант ауксотрофен, он растет только при добавлении в субстрат такого вещества, которое служит продуктом блокированной реакции. Однако возможны компенсирующие (супрессорные) мутации, которые создают альтернативные пути синтеза нужных для м.о. соединений.

Обратная, или возвратная, мутация называется реверсией, а образовавшийся организм или клетка — ревертантом.

Ревертировавшие до дикого типа особи не нуждаются в добавлении вещества D (продукта блокированной реакции), но осуществляет сверхсинтез вещества С (которое уже не является необходимым интермедиатом).

В тех случаях синтеза промежуточных метаболитов, когда механизм обратной связи нарушается, и происходит «обход» механизма ретроингибирования (схема на рис. 2.4) эффективно используются аналоги метаболитов.

Если субстрат содержит аналог (метаболит, который не включается в обмен веществ и оказывает токсическое действие), рост организма на стадии обхода подавляется, и в среде накапливается еще большее количество промежуточного метаболита С (см. рис. 2.4).

Таким путем — добавлением токсичного структурного аналога метаболитов, участвующих в альтернативном пути биосинтеза, была селекционирована морковь, клетки которой синтезировали в 20 раз больше метионина — незаменимой а.к.

При блокировании промежуточной реакции биосинтеза ауксотрофами становятся прототрофы — м.о., синтезирующие все вещества, необходимые для их развития.

В некоторых случаях решается обратная задача — переход от ауксотрофов к прототрофам.

Например, растительные клетки (эукариоты) не могут расти без фитогормонов (ауксины, цитокинины); эти клетки по существу являются ауксотрофами. Однако удалось выделить клоны, которые синтезируют природный гормон типа ауксина. Некоторые мутантные клетки синтезируют второй гормон роста — цитокинин. Такие (уже прототрофные) клетки размножаются бесконтрольно подобно раковым опухолям и являются источником очень ценных соединений.

Теория обратной связи в настоящее время дополнена рядом новых представлений о способах регулирования внутриклеточного метаболизма. Они появились в ходе исследований метаболических процессов на молекулярном и генном уровнях. Установлена роль веществ-индукторов, а также низкомолекулярных аффекторов; развиты представления о катаболитной репрессии.

Общая теория регулирования процессов внутриклеточного метаболизма. Общая теория регулирования метаболизма включает объяснение, как процессов непосредственного ингибирования деятельности энзимов, так и других приемов воздействия.

В норме все процессы обмена веществ уравновешены, отрегулированы. Для обеспечения сверхсинтеза какого-либо продукта метаболизма требуется нарушение регуляторных систем либо изменение генетической программы.

Изучение механизмов обмена веществ позволяет создавать организмы-сверхпродуценты и сознательно управлять процессами биосинтеза.

Координация любых химических превращений, которые обеспечивают метаболизм, осуществляется следующими основными путями:

  • • регуляцией активности энзимов, в том числе, путем ингибирования по принципу обратной связи; для этого варианта ингибирования принят термин «ретроингибирование»;
  • • регуляцией объема синтеза ферментов методами индукции и репрессии биосинтеза и методом экспрессии;

• регуляцией объема синтеза ферментов с использованием катаболитной репрессии.

Регуляция активности энзимов по механизму ретроингибирования заключается в том, что низкомолекулярные метаболиты передают информацию об уровне своей концентрации и состоянии обмена веществ ключевым ферментам. Ключевые ферменты регулируют периодичность в процессе функционирования необходимого для синтеза энзима ЕА (см. схему на рис. 2.3). Эти к.ф. являются аллостерическими белками, а конечные метаболиты в этом случае являются соответственно активаторами и ингибиторами (аффекторами). Таким образом, происходит саморегулирование биосинтеза. Таков же механизм действия аналогов метаболитов.

Регулирующими воздействиями на объем синтеза энзимов являются индукция (А), репрессия (Б), экспрессия (В), а также катаболитная репрессия.

А. Установлено, что не все энзимы синтезируются постоянно (т. е. не все являются конструктивными, необходимыми для жизнедеятельности м.о.). Некоторые появляются только при появлении в среде так называемых индукторов. Индукторами могут быть как субстраты, так и их аналоги. Например, при добавлении |3-галактозида лактозы в раствор, где культивируется Е. coli, происходит мгновенное появление нового энзима — (3-галактозидазы.

Регуляция объема биосинтеза фермента происходит на опе- ронном (см. приложение) уровне путем изменения количества иРНК.

При индукции метаболит-индуктор соединяется с продуктом гена-регулятора (репрессорный белок) и инактивирует его, создавая препятствие для взаимодействия этого белка с соответствующей зоной оператора. В результате к промотору присоединяется ДНК-полимераза и происходит активация синтеза иРНК.

Активируется синтез продукта биосинтеза.

Б. Конечные метаболиты в ряде случаев тормозят биосинтез энзимов. В этом случае увеличивается количество многих первичных метаболитов. Этот феномен называется репрессией.

Ингибитор-репрессор (конечный метаболит) переводит репрессорный белок в активную форму, которая оккупирует оператор (зона первоначального связывания РНК-полимеразы).

Энзимы, синтез которых таким образом подавляется, называются репрессибельными.

Репрессия является более грубым методом по сравнению с ретроингибированием, так как при этом нарушается передача наследственной информации.

Если одновременно с репрессией синтеза энзима концентрация конечного продукта уменьшается до определенного достаточно низкого уровня, то происходит дерепрессия, скорость биосинтеза возрастает.

В. В ответ на изменение окружающей среды: стресс, голодание, действие фагов клетки могут синтезировать различные низкомолекулярные аффекторы. Они взаимодействуют с определенными регуляторными белками, моделируя специфичность РНК-полимеразы. При этом запускается экспрессия определенного набора генов.

Катаболитная репрессия. Если в питательной среде имеется несколько источников углерода, клетка вырабатывает ферменты для предпочтительного усвоения одного из них, например, глюкозы. Только после полного расходования глюкозы происходит экспрессия ферментов метаболизма другого источника углерода, например лактозы. Это явление называется катаболитной репрессией (в данном случае репрессией ферментов усвоения лактозы глюкозой).

Белок-активатор катаболитных генов (БАК) формирует необходимый комплекс только в отсутствие глюкозы. Этот комплекс связывает РНК-полимеразу с соответствующей зоной промотора и начинается транскрипция генов трех ферментов, X, Y и А, контролирующих метаболизм лактозы в клетке.

В отсутствие комплекса ген-оператор связан с белком- репрессором.

Присутствие глюкозы подавляет образование необходимого комплекса.

Влияние регулирующих воздействий на результаты

селекции

На основании сказанного выше можно заключить, что дефекты в регуляции обмена веществ обеспечивают синтез целевых продуктов тремя способами.

  • 1. Изменение структуры аллостерического центра делает молекулу энзима нечувствительной к избытку целевого продукта. Идет сверхсинтез этого продукта.
  • 2. Если изменяется нуклеотидная последовательность в зоне гена-регулятора, то его продукт — белок-репрессор теряет способность связываться, либо с индуктором, либо с оператором. Исчезает эффект катаболитной экспрессии: способность усваивать данный субстрат уже не зависит от присутствия в питательной среде другого — мешающего и легче усваиваемого субстрата (индуцибельные ферменты становятся конститутивными).

Мутанты с дефектами регуляторной области оперона называются регуляторными. Они также обеспечивают сверхсинтез продукта.

3. Если в результате мутации происходит разрыв последовательности цепи биохимических реакций, в среде накапливается промежуточный целевой метаболит, использование которого блокировано.

Такой мутант ауксотрофен, он растет только при добавлении в питательную среду такого вещества, которое служит продуктом блокированной реакции.

Однако возможны компенсирующие (супрессорные) мутации, которые создают альтернативные пути синтеза нужных соединений.

Такая обратная мутация называется реверсией, а образовавшийся организм — ревертантом (см. выше).

К параграфу 2.3 см. приложение, термины «оперон», «оператор», «промотор».

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >