Методы и способы осуществления иммобилизации

Существует два принципиально разных технологических метода придания ферменту состояния иммобилизованности — физический (без образования ковалентных связей) и химический (с образованием связей).

Перечисленные методы имеют разновидности.

Физические методы

К физическим методам относятся адсорбция фермента на нерастворимом носителе, включение энзимов в поры поперечно-сшитого геля, в полупроницаемые структуры и в двухфазные системы (рис. 2.6).

Адсорбция на нерастворимых носителях. При адсорбции молекула удерживается на поверхности электростатическими, гидрофобными и дисперсионными взаимодействиями и водородными связями. Это был первый метод, но он не потерял своего значения и широко используется.

Описана иммобилизация более 70 ферментов на кремнеземе, активированном угле, графитовой саже, глине, пористом стекле, полисахаридах, синтетических полимерах, оксидах алюминия, титана и других металлов.

Методы иммобилизации биокатализатора

Рис. 2.6. Методы иммобилизации биокатализатора

Эффективность зависит от плотности центров сорбции и пористости носителя. Технология очень проста: раствор фермента смешивают со свежим осадком и высушивают. Активность фермента сохраняется на 100 %, а концентрация — до 64 г на 1 г носителя.

Недостатком является невысокая прочность связывания. Это приводит к потерям и загрязнению. Для улучшения адсорбции применяют обработку поверхности, например, полимерами, белками, липидами, и модификацию молекулы фермента.

Включение в гель. Этот способ прост и уникален. Пригоден, как для индивидуальных ферментов, так и для мультиэн- зимных комплексов, а также для клеток.

Существует два приема осуществления метода.

  • 1. Фермент вносят в водный раствор мономера, который затем полимеризуют. Образуется пространственная структура полимерного геля с включенными в его ячейки молекулами фермента (гели полиакриламида, поливинилового спирта, силикагеля и др.).
  • 2. Фермент вносят в раствор готового полимера, который затем переводят в гель (крахмал, агар-агар, фосфат кальция, агароза и др.).

В этом методе происходит равномерное распределение энзима в объеме носителя. Полученные матрицы обладают прочностью, а также химической и биологической стойкостью.

Однако метод непригоден для воздействия на водонерастворимые субстраты.

Иммобилизация ферментов в полупроницаемые структуры.

А. Метод заключается в разделении высокомолекулярного фермента и раствора низкомолекулярного субстрата и кофакторов с помощью полупроницаемой мембраны. Мембрана задерживает только крупные молекулы фермента.

Две разновидности:

  • • микрокапсулирование;
  • • включение фермента в липосомы.

Первый способ заключается в создании микрокапсул с полупроницаемыми стенками. Водный раствор фермента находится внутри.

Мембрана образуется из двух соединений: одно находится в водной фазе (например, водный раствор гексаметилендиа- мина — 1,6), а другое — в органической фазе (галогенанги- дрид себациновой кислоты):

Толщина мембраны (8) составляет сотые доли мкм, размеры капсулы — десятки и сотни мкм.

Метод непригоден для работы энзима с высокомолекулярными субстратами.

Б. Близким к инкапсулированию является метод включения водных растворов фермента в липосомы — системы двойных липидных слоев. Для этого раствор липида (лецитин) упаривают и получают пленку. Пленку диспергируют в водном растворе фермента.

Метод применяется для медицинских научных целей при изучения процессов, протекающих в клетке.

Химические способы иммобилизации

Это наиболее массовый способ получения промышленных биокатализаторов.

Носитель может обладать:

  • • гидроксильными группами,
  • • аминогруппами,
  • • карбоксильными,
  • • сульфгидрильными.

Схема метода показана на рис. 2.7.

Схема химического метода иммобилизации

Рис. 2.7. Схема химического метода иммобилизации

Вставка (сшивка, спейсер) выводит фермент из микроокружения носителя.

Например, для выведения галактозилтрансферазы применяют последовательность

В иммобилизации фермента не должны участвовать группы, которые существенны для его каталитической функции.

Эти методы сложные, дорогие и не находят широкого промышленного применения. Используются, в основном, в лабораторных исследованиях.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >