Проблемы иммобилизованных биокаталитических систем разных типов

Использование иммобилизованных систем очень затрудняется правильным выбором способа иммобилизации, при котором биокатализатор не терял бы активность и был достаточно дешев. Проблем здесь несколько. Прежде всего, необходимо получить изолированные ферменты. Нужно выделить их из природного источника и очистить. Этот этап — самый трудный.

Самыми дешевыми получаются ферменты из микроорганизмов, культур животных, растительных и грибных клеток. Самые дорогие — из тканей крупного рогатого скота и сельскохозяйственных культур.

Полученный изолированный фермент стабилизируют путем соиммобилизации.

Во всех методах иммобилизации фермент закрепляют в рабочей конформации, препятствующей денатурационным перестройкам. Таким образом, обеспечивается стабильность фермента при хранении и функционировании, устойчивость к воздействиям повышенной температуры, экстремальных pH и органических растворителей. Известно, что ди-, три- и тетрамеры ферментов, полученные путем сшивок, более термостабильны, чем мономеры.

В случае денатурации иммобилизованный фермент возвращается в исходное состояние, т. е. ренатурирует очень быстро. Часто каталитическая активность после денатурации восстанавливается самопроизвольно, хотя и требует длительного лаг-периода (индукционного). В течение этого периода молекула принимает разные конформации до тех пор, пока не найдет кратчайший путь к функционально активному состоянию.

Высказано мнение [6], что синтезированные в клетке полипептиды быстро принимают рабочую конформацию благодаря естественной иммобилизации на рибосомах.

Иммобилизованные ферменты, каждый привязанный к своему месту, разобщены. Поэтому они не агрегируют и не теряют активность. Если ферменты включены в микрокапсулы, они не подвержены действию микроорганизмов. Поэтому иммобилизация является способом длительного хранения энзимов. Многочисленные исследования показали, что иммобилизованные ферменты сохраняют каталитическую активность лучше, чем в свободном состоянии [8].

Однако в случае неудачного выбора метода происходит не только дестабилизация, а разрушение структуры.

Перспективно применение комбинации методов. Например, связывание с водорастворимым полимером с последующим пришиванием к кремниевому носителю препарата цел- лобиозы.

Наряду со стабилизацией часто наблюдается снижение активности фермента. Случаи полного сохранения активности и тем более дополнительной активации крайне редки. Это объясняется искажением структуры и затруднением доступа кофакторов и субстратов.

Изменение функциональных свойств изолированного фермента при иммобилизации. На характеристики фермента при иммобилизации влияет микроокружение, определяемое носителем. Поперечная сшивка молекул химотрипсина гидро- сукцинимидом приводит к сдвигу изоэлектрической точки от pH = 8 до pH = 5, и изменению других параметров.

Все эти изменения могут иметь как положительное, так и отрицательное значение.

Иммобилизацией фермента на анионном либо катионном полиэлектролите можно добиться сдвига оптимального pH либо в кислую либо в щелочную сторону. Для сахарофосфо- липазы при ее иммобилизации происходит расширение оптимальной зоны pH.

Иммобилизация приводит к снижению активности ингибиторов. Причиной является затрудненный доступ ингибиторов к ферменту. Это касается высокомолекулярных ингибиторов.

Известны даже случаи повышения устойчивости иммобилизованного фермента к низкомолекулярным ингибиторам. Иммобилизация L-аланинаминотрансферазы на коллагеновой мембране приводит к снижению ингибирующей активности двухвалентных ионов.

Практическое значение имеет тот факт, что водорастворимым ферментам при иммобилизации можно придать способность функционировать в неводной среде. Этому способствует способность носителя удерживать в себе воду.

Проблема регенерации кофакторов. Одностадийные реакции, не требующие кофакторов, относятся к процессам первого поколения: превращение глюкозы во фруктозу, гидролиз лактозы и др.

Процессы второго поколения являются многостадийными. Они зависят от разных кофакторов.

Примером является получение L-аминокислот из кетокис- лот:

Протекание этой реакции зависит от участия в ней кофер- мента NADH (никотинамидадениндинуклеотид NAD+) R=H:

Пополнение фонда NADH достигается окислением формиата до С02. Здесь Е1 и Е2 — соответственно дегидрогеназы кето- кислот и формиата.

Растворимые кофакторы уносятся током жидкости в проточном биореакторе. Но его простая иммобилизация недопустима — он совершает челночные движения.

Есть два подхода к решению проблемы.

  • 1. Кофактор пришивается к ферменту или его носителю через длинную и гибкую пространственную ножку. Однако это дорого и малоэффективно.
  • 2. Массу кофактора увеличивают присоединением к водорастворимым полимерам — декстрану, полиэтиленгликолю. Разбухший кофактор легко удерживается фильтром.

Иммобилизованные клетки

Преимущества иммобилизованных клеток:

  • 1) не требуется проводить отделение и очистку фермента;
  • 2) клетки имеют необходимые кофакторы и могут осуществлять как одно-, так и многостадийные процессы.

Поэтому там, где это возможно, используют клетки.

Иммобилизованные клетки являются эквивалентом инкапсулированных ферментов.

В этом случае из клеток вымывают все нежелательные вещества, которые могут инактивировать фермент, например, протеазы.

Живые клетки более капризны, но более перспективны. Однако их свойства непостоянны, они варьируются от одного поколения к другому. В ряде случаев иммобилизация стабилизирует клетку, останавливает ее развитие.

Покоящиеся клетки выигрышнее, чем делящиеся. Однако достижение такого состояния зависит от условий и метода стабилизации, подготовки биообъекта, предыстории культуры, состава питательной среды, фазы роста.

Рост клеток приводит к растрескиванию геля, к разрушению капсул. Но если продуктом служит клеточная масса, освободившиеся дочерние клетки уносятся из реактора в сепаратор, а материнские продолжают делиться.

В некоторых растительных клетках — продуцентах витаминов, пигментов и лекарственных соединений рост и синтез целевого продукта взаимно ингибируются.

Существуют методы получения покоящихся клеток. Их рост зависит от фитогормонов. Иммобилизованные, они более полно реализуют свой генетический потенциал (иногда в 10 раз больше, чем свободные).

Для подавления роста клеток применяют антибиотики.

Однако имеются случаи, когда синтез нужного продукта происходит только в условиях роста клетки и подавляется при прекращении роста.

Повышение проницаемости и стабильности иммобилизованных клеток. Повышение проницаемости клетки называется пермеабилизацией. Это помогает выделить в культуральную жидкость максимальное количество продукта, не накапливая его внутри.

Внутриклеточными являются немногие инженерные продукты и метаболиты растительных клеток.

Сама по себе иммобилизация повышает проницаемость клеточной мембраны. Но иногда применяется дополнительная обработка клеток органическими растворителями, изменением pH и др. Так клетки растения Morinda citrifolia обрабатывают диметилсульфоксидом для того, чтобы повысить выход антра- хинона. К повышению проницаемости приводит добавление фитогормонов и индукция роста корней. Можно радикально устранить клеточную стенку и использовать иммобилизованные протопласты.

Полезным приемом в работе с иммобилизованными клетками в составе гранул или других частиц является периодическая смена условий питания — перенесение клеток в богатую питательную среду. Это увеличивает активность и сроки полезного функционирования клеток. Таким приемом в 6 раз увеличивается продуктивность клеток Arthrobacter globiformis проявляющих З-кетостероид-Д'-дегидрогеназную активность. При этом одновременно минимизируется рост и деление клеток в рабочих условиях.

Клеточные органеллы

Изолированные хлоропласты, митохондрии, микросомы, лизосомы, пероксисомы и другие органеллы содержат полезные ферменты и одновременно свободны от других компонентов клетки. Выделение органеллы или группы органелл — более простая процедура, чем получение очищенного фермента. Они не растут и не делятся. Обладая собственной ДНК, они размножаются только в составе целой клетки. Активность клеток, например, пурпурных бактерий меняется от одной фазы развития к другой, но активность выделенных из этих бактерий фотосинтетических мембран длительно поддерживается на постоянном уровне, если не произойдет инактивация.

Так, существует способ синтеза за счет световой энергии такого ценного кофермента, как АТФ на основе АДФ и неорганического фосфата. Процесс осуществлен с использованием иммобилизованого и включенного в полиакриламидный гель хроматофора Rhodospirillum rubrum.

Другим важным примером использования органелл является преобразование световой энергии в электрическую энергию разности потенциалов на цитоплазматической мембране пурпурных бактерий. Они обитают в засоленных водах, например, Мертвого моря. Мембраны можно иммобилизовать на различных носителях и создать биотехнологические аналоги солнечных бактерий. Носителем может служить билипид- ная мембрана.

Соиммобилизованные каталитические системы

Возможна совместная иммобилизация двух и более ферментов, видов клеток, комбинаций ферментов и клеток. Это позволяет осуществить ряд процессов в культуральной жидкости (in vitro). Например, можно превратить кетокислоты в аминокислоты с одновременной регенерацией кофактора.

Можно осуществить многостадийные процессы с применением смешанных культур м.о. В частности, аскорбиновую кислоту получают действием соиммобилизованных клеток Gluconobacter melanogenes и Pseudomonas syringae.

При соиммобилизации ферментов и клеток возможны два варианта:

  • 1) клетки имеют ту же каталитическую активность, что и соиммобилизованный фермент. Это позволяет ускорить реакцию;
  • 2) клетки и фермент катализируют разные этапы сложной реакции.

Рассмотрим два примера соиммобилизации.

1. Смесь раствора фермента и клеток включают в полимерную структуру (схема на рис. 2.8).

Схема соиммобилизации клеток и молекул в полимерной структуре

Рис. 2.8. Схема соиммобилизации клеток и молекул в полимерной структуре

2. Соиммобилизация Asp. niger и (3-глюкозидазы предотвращает накопление промежуточного продукта — глюкозы при сбраживании целлобиозы до этанола. Таким образом предотвращается ингибирование процесса.

Схема метода показана на рис. 2.9.

Схема соиммобилизации клеток и молекул методом

Рис. 2.9. Схема соиммобилизации клеток и молекул методом

сшивки

При соиммобилизации клетки и ферменты должны быть функционально совместимыми.

Например, несовпадение оптимумов pH для катализаторов двух стадий реакции превращения крахмала во фруктозу:

глюкоамилаза клетки с глюкоизомеразной активностью

крахмал-? глюкоза---?фруктоза

не позволяет осуществить такой процесс.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >