Г. Идентификация клеток-реципиентов, которые приобрели желаемый ген

Успех генно-инженерной работы часто зависит от эффективности метода отбора клетки, несущей ген-мишень.

Часто его содержит лишь небольшая часть клеток.

Отбор проводят в два этапа.

Первая стадия. Отбор клеток, несущих данный вектор. Обычно это делают по генетическим маркерам. Так, высев на среду с антибиотиками позволяет обогатить бактериальную популяцию клетками, которые содержат векторы устойчивости к антибиотикам.

Вторая стадия. Поиск клеток, несущих ген-мишень.

Используют две группы методов.

Методы, основанные на непосредственном анализе ДНК клеток-реципиентов:

  • 1) определение нуклеотидной последовательности: из клеток, предположительно содержащих искомый ген, выделяют ДНК вектора, в которой проводят поиск участков, несущих этот ген, а затем проводят секвенирование (обычно части) нуклеотидной последовательности гена;
  • 2) гибридизация выделенной клетки с зондом, который может быть или интересующим геном или соответствующей ему мРНК. Для этого предварительно изолированную ДНК переводят в одноцепочечное состояние и вводят ее во взаимодействие с одноцепочечным ДНК- (или РНК-) зондом. Далее определяют присутствие гибридных двухцепочечных молекул ДНК.

Методы, основанные на идентификации признака, кодируемого геном:

  • 1) непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок— продукт гена-мишени или клеток, образующих соединение, в синтезе которого участвуют ферменты, кодированные геном (дрожжи, синтезирующие гистидин).
  • 2) использование селективных сред, поддерживающих рост только нужных клеток (для отбора клеток с ферментом для утилизации лактозы клетки выращивают на среде с лактозой как единственным источником углерода).
  • 3) иммунологическая детекция возможна в случае, если ген не влияет на фенотип организма. Примером может служить синтез а-интерферона, когда в среде имеются антитела к интерферону. Тогда, с целью бактериальные клетки лизируют, а затем проводят реакцию связывания антигена с антителами к а-интерферону.

К подпараграфу 2.5.4, п. Г см. приложение, термины «антидот», «гепарин», «протаминсулъфат», «протопласт», «сферо- пласт».

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >