Ферменты генной инженерии

В генной инженерии разработана определенная схема создания новой (химерной) клетки, показанная ниже (рис. 2.10, а также см. термин «трансформация» в приложении).

Из рисунка ясно, что схема включает операции расщепления плазмиды и затем — лигирования. При лигировании в плазмиду включается новый геном.

Все эти операции осуществляются с помощью специальных ферментов генной инженерии.

Перечислим главные ферменты генной инженерии:

  • 1) рестриктазы;
  • 2) ДНК-лигазы;
  • 3) ДНК-полимеразы;
  • 4) обратная рестриктаза;
  • 5) концевая дезоксинуклеотидная-трансфераза и др.
Схема получения гибридной ДНК с использованием чужеродных и плазмидных ДНК, расщепленных по методу

Рис. 2.10. Схема получения гибридной ДНК с использованием чужеродных и плазмидных ДНК, расщепленных по методу

in vitro

Рассмотрим функции этих ферментов.

1. Термины «рестриктаза», «эндонуклеаза рестрикции», «сайтспецифическая эндодезоксирибонуклеаза» являются синонимами.

Эти ферменты узнают определенные последовательности нуклеотидов и разрезают двунитьевую ДНК на фрагменты. При этом в клетке обязательно имеется фермент (метилаза), которая катализирует метилирование определенных оснований в последовательности, узнаваемой сопряженной рестриктазой. Тем самым осуществляется защита данного участка ДНК.

Одновременное наличие двух ферментных активностей (R-M система) препятствует гидролизу собственной нуклеиновой кислоты. Однако чужеродная ДНК, проникшая в клетку, служит субстратом для действия обоих ферментов.

Название рестриктаз отражает название типа микроорганизма, из которого они выделены.

Например, EcoR I и EcoR II — выделены из Escherichia coli.

Открыты сотни рестриктаз.

Самые простые — рестриктазы класса II. Это — белки из субъединиц одного типа со сравнительно небольшой молекулярной массой. Эти рестриктазы работают, когда в растворе присутствуют ионы Mg2+. Они узнают последовательности двухцепочечной ДНК длиной от четырех до восьми пар нуклеотидов, и имеющие ось симметрии II порядка (палиндромы). При этом ряд рестриктаз расщепляет ДНК строго по оси симметрии. Это приводит к образованию фрагментов с «тупыми» концами, не имеющими одноцепочечных участков:

Другой фермент EcoR I расщепляет гексануклеотидную последовательность с образованием 5' — выступающих взаимнокомплементарных липких концов:

Если таким образом гидролизовать молекулы ДНК разного происхождения, то в каждом случае образуется специфический набор фрагментов ДНК с одинаковыми липкими концами.

Для случайной последовательности ДНК бесконечной длины с равным содержанием четырех нуклеотидов (U = 4) вероятность наличия определенной последовательности длиной N составляет PN = U~N.

Существуют рестриктазы, которые обладают разной специфичностью, но образуют одинаковые липкие концы.

Если, узнавая одинаковую последовательность нуклеотидов, рестриктазы одинаково их расщепляют, они называются истинными изошизомерами. Но если они в этом случае расщепляют ДНК разным образом, их называют ложными изошизомерами.

2. ДНК-лигаза. Воссоединение разорванных молекул ДНК осуществляется с помощью ферментов, которые катализируют синтез фосфодиэфирной связи в двухцепочечной ДНК. Они называются ДНК-лигазами.

Удалось обнаружить два типа ДНК-лигаз: оба появляются в клетках Е. coli, инфицированных фагом Т4. Лигаза синтезируемая в клетке Е. coli в качестве кофактора требует дифосфо- пиридиннуклеотид, а лигаза фага Т4 — аденозинтрифосфат. Лигаза фага Т4 является более универсальной и воссоединяет как тупые, так и липкие концы.

3. ДНК-полимераза Е. coli. Этот фермент состоит из мономерной полипептидной цепи с молекулярной массой 103 кД и имеет трехдоменную структуру, которую можно разделить. Меньший фрагмент обладает 5'—3' экзонуклеазной активностью, а больший — 5'—3' и 3'—5' активностью.

ДНК-полимеразу используют для достройки одноцепочечных 5' концов на двухцепочечной ДНК до двухцепочечных тупых; для гидролиза одноцепочечных 3'-концов на двухцепочечных ДНК, а также для синтеза второй цепи на одноцепочечной ДНК.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >