Методы разрушения клеток

Разрушение (дезинтеграция) клеток проводится физическими, химическими и химико-ферментативными методами.

Промышленное значение имеют, в основном, физические методы:

  • 1) ультразвук;
  • 2) вращающиеся лопасти и вибраторы (используются в пилотных и промышленных установках);
  • 3) встряхивание со стеклянными бусами;
  • 4) продавливание через узкое отверстие под высоким давлением;
  • 5) раздавливание замороженной массы;
  • 6) растирание в ступке;
  • 7) осмотический шок;
  • 8) замораживание — оттаивание;
  • 9) сжатие клеточной суспензии с последующим резким снижением давления (декомпрессия).

Физические способы наиболее экономичны. Они не требуют дорогостоящих и дефицитных реактивов и ферментных препаратов.

Однако эти методы не избирательны. Лишь в отдельных случаях тонкая регулировка позволяет выделить конкретный индивидуальный продукт.

Химические и химико-ферментативные методы являются осторожными и избирательными. Так, клетки грамотрица- тельных бактерий обрабатывают лизоцимом в присутствии этилендиаминтетрауксусной кислоты, а клетки дрожжей — зимолиазой улитки или ферментами грибов. Для получения дрожжевого автолизата и ряда ферментов клеточные стенки м.о. разрушают обработкой толуолом или бутанолом. Так же действуют антибиотики, некоторые ПАВ и глицин.

Можно использовать автолиз клеток при лимитированном по определенному компоненту субстрата росте или лизис при заражении бактериофагом.

После дезинтеграции необходимо отделить фрагменты клеточных стенок. Для этого используют сепарирование и фильтрацию. Применяют более скоростные центрифуги и фильтры с меньшим диаметром пор, чем при отделении клеток, так как здесь частицы меньше.

Клеточные стенки отбрасывают как балласт, но иногда используют именно их.

Отделение и очистка продукта

Из культуральной жидкости или из гомогената разрушенных клеток продукт выделяется методами осаждения, экстракции и адсорбции.

Осаждение проводят физическими методами (нагревание, охлаждение, концентрирование) и химическим переводом в малорастворимое соединение. Так, белки осаждаются добавлением (NH4)2S04 и органических растворителей — этанола, ацетона.

Экстракция подразделяется на твердо-жидкофазную (перевод из твердого в жидкое) и жидко-жидкофазную (перевод из жидкого в жидкое).

Пример первого процесса — обливание руды водой после бактериальной обработки с извлечением растворимых солей.

Пример второго — экстракция витамина В12 фенолом или бензиновым спиртом.

Эффект экстракции повышается разными приемами — многократной обработкой свежими порциями растворителя, правильным выбором растворителя, нагреванием, понижением давления.

Разработан метод криоэкстракции (на холоде), в этом случае нивелируется различие между фазами. Таким образом, органические кислоты извлекают аммиаком в виде солей аммония. Неполярные соединения извлекают пропаном или бутаном. При последующем осторожном подогревании они улетучиваются.

Адсорбция — это частный случай извлечения растворенного вещества в другую фазу, когда извлекателем является твердое тело. Так, для выделения антибиотиков и витаминов применяют древесный уголь и глины.

Современные методы разделения — хроматография, электрофорез, изотахофорез, электрофокусировка основаны на принципах экстракции и адсорбции.

Хроматография основана на распределении вещества между несмешивающимися фазами.

Различают хроматографию на бумаге, пластинках, колонках.

Одна из фаз — неподвижная (бумага, силикагель, гранулированный гель). Вторая — подвижная (движущийся растворитель).

Колоночная хроматография чаще используется в промышленных способах разделения. Она имеет разновидности — ионообменная, молекулярная, аффинная.

  • 1. Ионообменная основана на том, что гранулы адсорбента (карбоксиметилцеллюлоза) несут заряженные группы: либо катионные (-NH3+), либо анионные (-S03). Они захватывают ионы противоположного знака (например, цеолит смягчает воду, задерживая Са2+ и Mg2+).
  • 2. Молекулярная основана на разделении по принципу разной молекулярной массы или диаметра (метод молекулярных сит, гель-хроматография, гель-флотация). Адсорбент захватывает и удерживает молекулы определенного размера. На рис. 3.4 показано, что задерживание компонента раствора в этом случае происходит за счет пространственного соответствия размера задерживаемой частицы и диаметра каналов между частицами, наполняющими колонну.
  • 3. Аффинная хроматография — это способ, в котором задерживается компонент, образующий комплекс с лигандом, фиксированном на носителе. Например, фермент очищают путем связывания на колонке, несущей субстрат или специфический ингибитор. На рис. 3.4 показано, что задерживание компонента раствора в этом случае происходит за счет пространственного соответствия формы задерживаемой частицы и параметров микрорельефа у наполнителя колонны.
Хроматографические методы очистки ферментов

Рис. 3.4. Хроматографические методы очистки ферментов

Хроматография, основанная на взаимодействии антигенов и антител, называется иммуноафинной. Этот метод позволил за один этап провести 500-кратную очистку человеческого интерферона.

В аффинной хроматографии используются также групповые лиганды, связывающие сходные по структуре ферменты или лиганды, связывающие определенные классы веществ, например, красители.

Сложные многокомпонентные смеси — культуральные жидкости, экстракты клеток методом аффинной хроматографии полностью очищаются за одну стадию с небольшими затратами труда и времени. Недостатком являются дороговизна материалов-лигандов и необходимость их очистки, регенерации.

После пропускания через колонку порции культуральной жидкости частицы геля должны быть очищены.

Методы очистки основаны на эффектах:

  • 1) плотность частиц геля должна быть выше плотности частиц, которые закупоривают колонку, тогда гель легко промывается;
  • 2) гель и загрязняющие частицы должны отличаться магнитными свойствами, это позволяет разделить их в магнитном поле;
  • 3) частицы геля упаковываются на ленте, имеющей вид ячеистой оболочки; лента, вращаясь, проходит то через раствор с продуктом, то через буферный раствор, куда и переходят загрязнения.

Очищающий гель изготавливается из агарозы. Это — непрочный материал, он не позволяет делать колонку высокой и широкой, так как при этом нижние слои раздавливаются, а центральные не поддерживаются стенкой. Мелкие частицы геля, наиболее эффективные для очистки, уносятся потоком жидкости.

Поэтому стоит задача укреплять этот гель.

В крупномасштабном разделении и очистке продуктов биотехнологии используются также приемы аффинной преципитации и аффинного разделения.

Аффинная преципитация заключается в том, что лиганд прикрепляется к растворимому носителю. При добавлении в раствор смеси, содержащей выделяемый белок, он присоединяется к лиганду и образует нерастворимый осадок.

Биомембранные системы] — можно использовать для создания высокоэффективных биореакторов. При этом сочетаются биологические и мембранные процессы. В одном из вариантов такого реактора культуральная жидкость фильтруется через мембранный биофильтр и освобождается, таким образом, от клеток. Бесклеточная жидкость б.к.ж. возвращается в биореактор.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >