Производство ферментов

Ферменты, синтезированные в клетке, сохраняют свои уникальные каталитические свойства и после выделения из клетки. Поэтому их используют широко. Как катализаторы они работают в мягких условиях, нетоксичны и доступны.

По объему это производство в биотехнологии занимает третье место. В различных отраслях промышленности применяют около 30 ферментов. Они используются в текстильном, целлюлозно-бумажном и кожевенном производстве, в медицинской и химической промышленности, а также в качестве детергентов, в производстве кондитерских изделий и соков.

Основным потребителем является пищевая промышленность. Наиболее используемыми ферментами являются глюко- оксидаза и глюкоизомераза, которые применяются для приготовления сиропов, содержащих фруктозу.

Ферменты, коферменты участвуют во многих технологических процессах. В качестве примеров назовем:

• ферментные мембранные реакторы для осуществления непрерывных процессов восстановительного аминирования кетокислот и др.;

  • • разделение рацематов стереоспецифически активным транспортом, например, для прокачивания D-глюкозы;
  • • высокоэффективное окисление метанола в муравьиную кислоту под действием сопряженных ферментативных систем дрожжей Hansenula polymorpha и бактерий Pseudomonas putida.

Большое будущее имеют процессы с участием панкреатического фермента свиньи липазы. Этот фермент сохраняет активность даже при влажности всего лишь 0,015 % и при 100°С. С его помощью синтезируют оптически чистые сложные эфиры и феромоны для парфюмерии и медицины.

Ферменты разных классов используются для осуществления деградации и модификации антропогенных загрязнений окружающей среды.

Так, в 1886 г. А. Я. Данилевский доказал возможность обращения протеолиза и возможность синтеза белковых веществ с помощью синтеза белковых соединений при участии протеолитических ферментов. В сточных водах очень велика концентрация аминокислот и пептидов, которые образуются при гидролизе белковых отходов под действием пептидогидролаз микроорганизмов. Во Франции уже действует производство кормовых белков из сточных вод.

Широко применяются ферменты в медицине в составе лечебных препаратов:

  • • при пероральном введении фенилаланин-аммиак-лиазы, резко снижается уровень содержания фенилаланина в крови при фенилкетонурии;
  • • для лечения злокачественных новообразований применяются гидролитические ферменты протеиназы (препарат «папайотин»);
  • • для растворения тромбов в кровеносных сосудах также применяют протеолитические ферменты плазмин и активирующие его стрептокиназу и урокиназу;
  • • для рассасывания рубцовых образований используют коллагеназу;
  • • для задержки развития атеросклероза используют эла- стазу;
  • • для лечения конъюнктивитов применяют лизоцим;
  • • для лечения заболеваний дыхательных путей и роговицы глаз используют дезоксирибонуклеазу из стрептококка.

Важнейшей областью медицины является также энзимоди- агностика — тестирование патологии по уровню активности ферментов, а также для блокировки отторжения органов и других целей.

Производство ферментных препаратов растет. В этой области доминирует Западная Европа, а также США и Япония.

Источники ферментов

Содержание искомого энзима в природном объекте для производства должно составлять не менее 1 %. Для крупномасштабного производства сырьем служит очень ограниченное количество растительных организмов на определенной стадии развития и отдельные ткани и органы животных.

В частности пригодны проросшее зерно некоторых злаков и бобовых, латекс и сок зеленой массы некоторых растений.

Животным сырьем служат поджелудочная железа, слизистая оболочка желудочно-кишечного тракта, сычуг к.р.с., семенники.

Неограниченным источником ферментов являются многие м.о. — бактерии, грибы, дрожжи.

Технология культивирования м.о. — продуцентов ферментов

Технология зависит от источника энзима:

  • • при извлечении фермента из растительных или животных тканей энзимы экстрагируют, а затем очищают от балластных веществ;
  • • для получения препаратов микробного происхождения технология включает этапы культивирования м.о. — продуцентов, в том числе получение посевного материала.

Для получения посевного материала используют лабораторный штамм чистой культуры, выращенный на твердой или жидкой питательной среде до определенного возраста.

Такой материал консервируют высушиванием или хранением при низкой температуре. Производственные культуры продуцента получают из посевного материала выращиванием на поверхности твердых или жидких сред либо методом глубинного культивирования.

Поверхностный метод состоит в культивировании на поверхности увлажненных стерилизованных отрубей в специальных кюветах с добавлением солодовых ростков, опилок или свекловичного жома.

Для глубинного культивирования применяют ферментеры из нержавеющей стали с перемешиванием и подачей воздуха.

Вначале ферментер заполняют питательной средой, автоклавируют, а затем засевают. Принимают меры для предотвращения инфекции — повышенное давление, оптимальный pH, температура, редокс-потенциал.

Проточный метод культивирования заключается в том, что питательная среда и посевной материал подаются в ферментер непрерывно. Ферментером служит вращающийся трубчатый реактор. В один его конец поступает питательная среда и культура м.о., а из другого непрерывно выводятся ферменты, бактериальная масса и продукты жизнедеятельности. Здесь можно создать условия, когда культура нормально размножается до 200 суток.

Важным фактором является качество питательной среды. Используются как синтетические, так и комплексные среды. Синтетические среды представляют собой определенный набор питательных веществ. В состав комплексных входят различные отходы пищевых производств — жмыхи, спиртовая барда, картофельная мезга, отруби, меласса и др. Эти среды доступны, дешевы и обеспечивают безотходность производства.

Типовая технологическая схема глубинного культивирования м.о. приведена на рис. 4.2.

Принципиальная технологическая схема глубинного культивирования микроорганизмов (по А. А. Свитцову и др

Рис. 4.2. Принципиальная технологическая схема глубинного культивирования микроорганизмов (по А. А. Свитцову и др.,

  • 1986):
  • 1 — смеситель питательной среды; 2 — стерилизатор в непрерывном режиме потока питательной среды; 3,4 — теплообменники; 5 — посевные аппараты; 6, 10, 12 — фильтры для очистки воздуха; 7 — ферментер; 8,9 — насосы; 11 — компрессор

Технология очистки и выделения ферментных препаратов

Выделение и очистка — трудоемкая и дорогостоящая операция. Хорошо, если очищать продукт нет необходимости. Так, спиртовая, кожевенная, текстильная промышленность, сельское хозяйство и предприятия бытовой химии не требуют чистоту фермента выше 0,1 % (примеси 99,9 %).

Но научные исследования и медицина требуют полной очистки от балласта. Тогда выбирают метод очистки в зависимости от исходного для очистки материала:

  • • биомасса продуцента;
  • • фильтрат культуральной жидкости;
  • • экстракт из тканей и органов растений и животных.

Для получения неочищенного препарата культуру м.о. вместе с остатками культуральной жидкости высушивают в мягких условиях. Применяют также упаривание экстракта или фильтрата культуральной жидкости.

Применяют метод ацетоновых порошков: осаждение и быстрое обезвоживание ацетоном при температуре не выше, чем -10°С. Получаются порошки либо жидкие концентраты.

Для выделения фермента из клеточного содержимого его тонко измельчают до разрушения внутриклеточных структур — лизосом, митохондрий, ядер и др.

Для этого применяют мельницы и гомогенизаторы; ультразвук; попеременное оттаивание и замораживание. Для высвобождения ферментов добавляют небольшие количества детергентов или обрабатывают энзимами — лизоцимом, целлюлазой и др. Необходимо исключить денатурацию белка.

При получении очищенных препаратов и ферментов комбинируют различные методы и приемы: термическое фракционирование, осаждение органическими растворителями, электролитами и солями тяжелых металлов, фильтрацию, электрофорез, ионообменную хроматографию и др.

Для заключительных этапов тонкой очистки применяют аффинную хроматографию, в которой избирательно связываются те или иные лиганды. Этот метод позволяет выделить энзим из множества других белков.

Для синтеза сорбента в этом методе лиганд присоединяют к инертной матрице (гидрофильные гели, синтетические полимеры, неорганические носители). Для уменьшения пространственных затруднений лиганд присоединяют к носителю через промежуточное звено (ножка, спейсер, вставка), как описано выше.

Для адсорбции на сефарозе (вид агарозы) в качестве активатора применяют бромциан.

Активированный сорбент взаимодействует с каталитическим центром фермента только благодаря сходству лиганда с субстратом (ферментом). Такой пример показан на приведенной здесь схеме.

Для протеолитических ферментов в качестве лиганда используют циклопептидный антибиотик грамицидин.

В процессе выделения фермента повышается его массовая доля, и, следовательно, повышается активность.

В производственных условиях активность ферментного препарата оценивается количеством субстрата, преобразованного 1 мг (1 кг) препарата при оптимальных условиях за 1 мин и измеряется в Е/мг (например, протеолитических единиц), моль/мг или катал/кг белка (1 международная единица в системе СИ равна 16,6 нанокатал, katal).

Очищенные препараты хранят при низкой температуре (-80°С). Добавляются различные стабилизаторы — коферменты, глицерин, моносахариды, аминокислоты, желатина и др.

В настоящее время выделено и очищено 1500 ферментов из 2003 известных.

В 1960-е гг. на стыке химии и биологии появилась новая отрасль — энзимология. Ее задачами являются развитие прогрессивных методов выделения ферментов, их стабилизация и иммобилизация; конструирование ферментов методами генной инженерии и разработка научных основ их применения.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >