Типовые технологические приемы

Генетическая инженерия

Сущность: внедрение отдельных генов (или комплекса генов) организма одного вида в геном организма другого вида.

Методы. Полученный из ДНК человека (или другого организма) структурный ген обрабатывают специальным ферментом, в результате чего у него образуются «липкие» концы. Выделенную из бактерии плазмиду (после превращения ее кольцевидной молекулы ДНК в линейную путем «разрезания» особым ферментом) подвергают аналогичной процедуре. Полученные таким образом молекулы ДНК с «липкими» концами сшивают в кольцевидный гибрид «человеческий ген — бактериальная плазмида», который вводят в живую бактерию. В бактериальной клетке гибридная молекула ДНК многократно реплицируется. Затем с встроенного в ее состав структурного гена человека снимается копия и PH К, на основе которой в рибосомах синтезируется соответствующий белок. После наработки последнего в достаточных количествах (процесс осуществляется в специальных агрегатах большого объема — ферментерах в условиях избытка питательных веществ и кислорода) бактериальные клетки разрушают и выделяют искомый белок.

Другой методический подход заключается в непосредственном введении исследуемого структурного гена (изолированного или в составе комплекса ген-плазмида) в ядро клетки-реципиента (чаще всего зиготы) путем микроинъекции.

С положительной стороны зарекомендовал себя метод генетической трансформации растений при помощи природного «генного инженера» — почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens. Особые ферментные системы бактерии данного вида вырезают комплекс генов, переносят его из бактерии в клетку растения и встраивают в хромосомную ДНК. Из множества полученных трансформантов путем прямых селекционных методик отбирают те, в которых произошла экспрессия искомого гена. Таким образом были получены сорта табака, устойчивые к вирусу табачной мозаики.

Не утратил своего значения и самый простой метод переноса генетического материала от одного вида организмов другому. Речь идет о добавлении в культуральную среду, в которой развиваются бактерии одного вида, ДНК, полученной из бактерий другого вида. Несмотря на то что тонкие механизмы проникновения «чужеродной» ДНК в бактериальную клетку до конца не ясны, сам факт убедительно доказан и сомнений не вызывает. Примечательно, что именно данный методический прием позволил впервые осуществить межвидовую «пересадку» полного генома. Эксперименты проводили на наиболее просто организованных бактериях — микоплазмах, не имеющих клеточной стенки и содержащих очень небольшой геном (600—1400 тыс. пар оснований).

Принципиально иным подходом к созданию генетически модифицированных организмов является внесение в их геном таких изменений, в результате которых уменьшается (или полностью выключается) уровень экспрессии того или иного из их собственных генов. Для этого в геном встраивается предварительно изготовленная генетическая конструкция, содержащая ген-мишень в перевернутом виде. В этих условиях синтезируется РНК, которая ничего не кодирует, но эффективно связывается с и PH К гена-мишени и нейтрализует се, что приводит к остановке трансляции. Поскольку данный метод не сопряжен с интеграцией в геном организма «чужеродного» гена, кодирующего белок, полученные с его помощью организмы предложено называть генетически модифицированными нетрансгенными. Таким образом были получены стрессоустойчивые формы растений (к засухе, засолению, холоду и др.).

Перспективы. Исследования в этом направлении привели к разработке методов введения необходимого гена (генов) в клетки животных и человека и создания условий для его длительного существования и эффективной экспрессии. При этом искомый ген вводят в клетки в виде «голой» ДНК, или встроенным в структуру ДНК плазмиды либо вируса, или в составе искусственных липо- нротеидиых частиц — липосом. Некоторые из этих методов проходят клинические испытания, и с их помощью, возможно, будут лечить такие наследственные заболевания (мышечная дистрофия, гемофилия, болезнь Паркинсона идр.) и болезни (злокачественные опухоли, диабет, атеросклероз, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки), в развитии которых генетический фактор играет существенную роль. В качестве положительного примера можно привести успешную попытку лечения меланомы - одной из наиболее коварных злокачественных опухолей. Установлено, что у больных с этой опухолью в Т-лимфоцитах нарушена структура (или подавлена экспрессия) гена, кодирующего поверхностный (мембранный) рецептор, ответственный за распознавание опухолевых клеток. В геном изолированных из крови пациентов- опухоленосителей Т-лимфоцитов интегрировали аналогичный ген, выделенный из Т-лимфоцитов здоровых людей. После прохождения курса химиотерапии, в результате которой активность иммунной системы была существенно снижена и число иммуио- компетентных клеток резко уменьшилось, больным ввели ранее взятые у них Т-лимфоциты с внедренным в геном «нормальным» геном. Через 1,5 года у большинства больных наблюдалась полная или частичная регрессия опухоли. Другим примером является успешная попытка генотерапии Х-сцепленного комбинированного иммунодефицита, обусловленного накоплением токсичного для лимфоцитов дезоки-АТФ вследствие недостаточности фермента аденозиндезаминазы. У таких больных нарушены механизмы клеточного и гуморального иммунитета, что клинически проявляется в частых тяжелых инфекциях. Положительный терапевтический эффект был получен после введения больным их собственных лимфоцитов, в которые предварительно с помощью вирусного вектора был внедрен ген аденозиндезаминазы человека.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >