Нормальная микрофлора тела животного

ТЕЛА ЖИВОТНОГО

Понятие о микробиоте и микробиоме организма животных. С современных позиций нормальную микрофлору следует рассматривать как совокупность множества микроорганизмов, характеризующуюся определенным составом и занимающую тот или иной биотоп в организме человека и животных. В любом микробиоценозе следует различать постоянно встречающиеся виды микроорганизмов, так называемые характерные виды (автохтонная флора), добавочные и случайные виды (транзиторная, или аллохтонная флора). Количество характерных видов, как правило, относительно невелико, зато численно они всегда представлены наиболее обильно. Самые сложные и густонаселенные разнообразными микроорганизмами микробиоценозы у млекопитающих — это микрофлора ЖКТ. На примере кишечной экологической системы показано существование весьма сложной и разветвленной кооперации между населяющими кишечник популяциями микроорганизмов. Недостаток или избыток того или иного субстрата или метаболита служит толчком для усиленного роста или гибели соответствующего звена экологической системы. В настоящее время для характеристики микробных сообществ организма применяется термин «микробиота» — экологическое сообщество различных микроорганизмов. В состав микробиоты входят бактерии, археи, простейшие, грибы и вирусы. В качестве синонима термина «микробиота» часто употребляют термин «микробиом», который описывает либо коллективный геном микроорганизмов, которые находятся в экологической нише, либо сами микроорганизмы.

К настоящему времени выявлены некоторые общие закономерности заселения организма человека и животных микроорганизмами. Наиболее полно этот процесс исследован в отношении ЖКТ. Установлено, что в первые часы и дни в кишечнике новорожденных преимущественно встречаются микрококки, стафилококки, энтерококки, клостридии. Затем появляются энтеробактерии, в первую очередь кишечные палочки, лактобациллы и бифидобактерии. Со временем в кишечнике обнаруживаются, а затем начинают доминировать неспороносные облигатно-анаэробные бактерии (бифидобактерии, эубактерии, бактероиды, пептококки, спириллы). В первые 2—3 недели жизни состав микрофлоры подвержен значительным колебаниям. Нормальная микрофлора, схожая с таковой у взрослых особей, обычно устанавливается к концу первого месяца после рождения (рис. 1, цв. вклейка) [2].

В зависимости от вида животного скорее, как правило, может меняться количество микробных групп, но не их состав.

Функции нормальной микрофлоры:

• • участие в водно-солевом обмене;
• • участие в обеспечении колонизационной резистентности, иммуногенная роль;
• • регуляция газового состава кишечника и других полостей организма хозяина;
• • морфокинетическое действие;
• • продукция энзимов, участвующих в метаболизме белков, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот;
• • продукция биологически активных соединений (витамины, антибиотики, гормоны и т. д.);
• • участие в рециркуляции желчных кислот, холестерина и других макромолекул;
• • мутагенная / антимутагенная роль;
• • детоксикация экзогенных и эндогенных субстратов и метаболитов;
• • источник микробных, плазмидных и хромосомных генов.

Говоря о роли нормальной микрофлоры, следует иметь в виду, что ее представители способны выступать и как фактор агрессии. Так, установлено, что бета-токсин Clostridium perfringens — микроорганизма, постоянно обнаруживаемого в кишечнике животного и человека в небольших количествах, индуцирует высвобождение катехоламинов, что приводит к повышению кровяного давления.

Представители нормальной микрофлоры при определенных условиях могут выступать в качестве этиологических агентов гнойновоспалительных заболеваний и способствовать развитию аллергических процессов.

Методы, применяемые для изучения микробиоты организма животных.

Культуральные методы. Классические культуральные микробиологические методы довольно широко применялись и применяются в настоящее время для изучения микрофлоры тела животного. Однако эти методы оказались наиболее эффективны при выделении определенного патогенного микроорганизма из клинического материала (например, кишечной палочки при колибактериозе молодняка). Эти методы позволяют определить биохимические свойства возбудителей, их вирулентность, чувствительность возбудителей к антибиотикам, а также провести генотипирование. Вместе с тем в настоящее время хорошо известно, что методы культивирования бактерий не дают достаточной информации о микробном разнообразии в сложных биологических экосистемах из-за существенных ограничений их применения. Обусловлено это следующими причинами:

• • в настоящее время недостаточно информации о ростовых требованиях большинства микроорганизмов, что объясняет, почему только небольшая часть кишечных микробов может быть выращена на питательных средах;
• • желудочно-кишечный тракт заселен преимущественно анаэробными бактериями, которые могут погибнуть при взятии образцов для исследования;
• • многие микробы живут только в симбиозе с другими микроорганизмами или организмом хозяина, что создает непреодолимые препятствия для их культивирования;
• • многие селективные питательные среды не обладают достаточной специфичностью, на них часто вырастает посторонняя микрофлора;
• • зачастую существующие биохимические и фенотипические системы идентификации не позволяют точно классифицировать многие микроорганизмы, поэтому часто требуется секвенирование ДНК культуральных изолятов.

Достоверно известно, например, что из-за всех перечисленных ограничений современная микробиологическая техника не позволяет культивировать до 7—50 % анаэробов, присутствующих в организме человека и животного и гораздо меньшее число микробов может быть правильно идентифицировано.

Молекулярно-генетические ^метагеномные) методы. Метагеномика — это дисциплина, позволяетющая проводить геномные исследования микроорганизмов, которые в принципе не растут на питательных средах в условиях лаборатории. Более быстрые, более дешевые технологии секвенирования и возможность секвенирования этих микроорганизмов, отобранных непосредственно из их мест обитания, расширяют и трансформируют представление о мире микробов. С помощью этих методов были получены новые данные о микробиоте отдельных участков организма и позволило выявить микроорганизмы там, где они ранее не обнаруживались. Таким образом, можно с уверенностью сказать, что развитие методов молекулярно-генетического анализа, направленного на идентификацию микроорганизмов, произвело революцию и открыло еще одну «золотую лихорадку» в изучении микробиома организма.

Геномная характеристика бактериального разнообразия основана на анализе последовательности гена рибосомальной РНК 16S, который присутствует у всех бактерий и архей, но отсутствует у эукариот. Ген 16S рРНК содержит вариабельные области, обеспечивающие таксономическую классификацию, и консервативные области, служащие сайтами связывания для праймеров ПЦР. При этом очень отметить, что микрорганизм не нуждается в культивировании для определения его вида с помощью секвенирования 16s рРНК. В том числе для этих целей используют экологическое секвенирование генома методом «дробовика» (рис. 2.1) [14].

Рис 2.1. Экологическое секвенирование методом «дробовика»:

А — отбор проб из среды обитания; В — фильтрция частицы, обычно по размеру; С — лизис и экстракция ДНК; D — клонирование и создание библиотеки; Е — секвенирование клонов; F — сборка последовательности

Вместе с тем информация о геномном составе микробного сообщества дает представление о его функциональном потенциале, но не позволяет сделать вывод о функциональной активности микробиоты, которую она выполняет при определенных условиях или в определенный момент времени. Для достижения этой цели дополнительные данные могут быть получены от микробного сообщества средствами метатранскриптомики, метапротеомики и метаболо-мики. Данные технологии обеспечивают уникальную перспективу, и путем интеграции этих крупномасштабных наборов данных можно исследовать микробное сообщество, его динамику и взаимодействие с организмом хозяина. В качестве примера можно привести комплекс подходов для изучения микробиоты молока (рис. 2.2) [2].

Рис. 2.2. Изложение доступных подходов для изучения микробиоты молока

Структура микробиоты млекопитающих, рыб и растений в сельском хозяйстве. В настоящее время в сельском хозяйстве уделяется большое внимание микробиоте животных, рыб и растений. Учитывая то, что микробиомы животных и растений охватывают разнообразные микробные сообщества, которые колонизируют каждую доступную ткань организма-хозяина и зачастую приносят ему пользу, благоприятно воздействуя на его здоровье и физическое состояние, предпринимаются попытки искусственного подбора микробиомов. Это так называемый инженерный подход к отбору микробиома. Однако в настоящее время трудно использовать микробные данные для улучшения свойств хозяев из-за отсутствия определения и критериев «оптимальной микробиоты» у млекопитающих, рыб и растений. Объясняется это недостаточным количеством проведенных исследований, а также тем, что сведения о микробиоте, полученной от сельскохозяйственных животных, рыбы, выращенной в аквакультуре, и возделываемых растений, могут в значительной мере зависеть от сложных экологических факторов, таких как климат, масштабы культивирования и использование антибиотиков и удобрений, которые могут варьироваться в зависимости от различных стран и регионов. Кроме того, микробиота сельскохозяйственных организмов может отражать большую изменчивость видов и генотипов хозяев, биологических функций на разных стадиях развития, а также макро- и микроструктур колонизирующих объектов, которые не до конца изучены в качестве лабораторных моделей. Из-за общего ограниченного понимания микробиоты в агроэкосистемах на данный момент нелегко определить «оптимальную микробиоту», которая может оптимизировать рост, питание хозяина и иммунитет сельскохозяйственных организмов.

Важность понимания структуры и функций микробиоты в сельском хозяйстве также широко обсуждается в контексте распространения устойчивости к противомикробным препаратам от животных к человеку. В то же время коррекция микробиоты пробиотиками в сельском хозяйстве является перспективной стратегией для борьбы с развитием антибиотикоустойчивости и микроорганизмов, поскольку пробиотические препараты в настоящее время рассматриваются как альтернатива антибиотика, несмотря на более высокую стоимость.

Проведенные исследования установили, что микробиота млекопитающих, рыб и растений очень разнообразна и может содержать до 20 бактериальных типов, но при этом общей чертой является то, что, как правило, три типа — Proteobacteria, Firmicutes и Bacteroidetes — доминируют в бактериальном сообществе (рис. 2, цв. вклейка) [7].

Менее распространенные типы включают Actinobacteria, которые обычно довольно часто встречаются, но изменчивы на более низких таксономических уровнях (например, Streptomycetaceae, Microbacteriaceae и Corynebacteriaceae), в то время как Fusobacteria и Acidobacteria обычно в большей степени выделяются от животных, рыб и растений соответственно).

Fusobacteria являются основной группой бактерий кишечного микробиома некоторых морских и пресноводных рыб. Chloroflexi, Cyanobacteria, Planctomycetes, Spirochaetes и Verrucomicrobia спорадически встречаются в виде субдоминантных типов. Высокое обилие факультативно-анаэробных Proteobacteria у животных, рыб и растений отражает преимущества факультативных анаэробов в непосредственной близости от организма хозяина, где строгие анаэробы подвергаются риску воздействия кислорода, а строгие аэробы могут столкнуться с серьезной конкуренцией за кислород. Преимуществом факультативно-анаэробных бактерий является то, что они обладают очень гибкими метаболическими свойствами: они способны генерировать энергию путем ферментации или использовать неорганические соединения азота. В условиях окисления они быстро растут, используя кислород. Разрушаются и накапливаются самые разнообразные органические соединения, которые существенно изменяют условия окружающей среды. Среди представителей Proteobacteria есть симбионты, условно-патогенные и патогеные бактерии.

Популяцию Firmicutes у животных, рыб и растений можно условно разделить на две группы: молочнокислые бактерии из отрядов Bacillales и Lactobacillales, а также анаэробные ферментативные бактерии, связанные с клостридиями, такими как Clostridiaceae и Ruminococcaceae.

Что касается типа Bacteroidetes, колонизирующие животных, рыбу и растения, чаще всего представлены Flavobacteriaceae, Bacteroidaceae и Prevotellaceae.

Контрольные вопросы и задания

• 1. Дайте определение понятий «транзиторная» и «автохтонная микрофлора».
• 2. Чем отличается термин «микробиом» от термина «микробиота»?
• 3. Перечислите функции нормальной микрофлоры.
• 4. Охарактеризуйте методы, применяемые для изучения микробиома.
• 5. Охарактеризуйте структуру микробиоты млекопитающих, рыб и растений в сельском хозяйстве.

Библиографический список

• 1. Absolute metabolite concentrations and implied enzyme active site occupancy in Escherichia coli / B. D. Bennett [et al.] // Nat Chem Biol. 2009. 5:593-9.
• 2. Addis, M. F. The bovine milk microbiota: insights and perspectives from -omics studies / M. F. Addis [et al.] // Mol. BioSyst., 2016. 12:2359-2372.
• 3. Backhed, F. Host-Bacterial Mutualism in the Human Intestine / F. Backhed [et al.] // Science. 2005. 307(5717):1915-1920.
• 4. Dethlefsen, L. An ecological and evolutionary perspective on human-Microbe mutualism and disease / L. Dethlefsen, M. McFall-Ngai, D. A. Reiman // Nature. 2007. 449:811-8.
• 5. Dobrindt, U. Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms / U. Dobrindt [et al.] // Nat. Rev. Microbiol. 2004. 2:414.
• 6. Evidence for a core gut microbiota in the zebrafish / G. Roeselers [et al.] // ISME J. 2011. 5:1595-608.
• 7. How Can We Define «Optimal Microbiota?»: A Comparative Review of Structure and Functions of Microbiota of Animals, Fish, and Plants in Agriculture / W. Ikeda-Ohtsubo [et al.] // Frontiers in Nutrition. — 2018. — Vol. 5.
• 8. Lederberg, J. Ome Sweet ‘Omics — a genealogical treasury of words / J. Lederberg, A. T. McCray // Scientist. 2001. 15:8.

• 9. Microbiota and host nutrition across plant and animal kingdoms / S. Hacquard [et al.] // Cell Host Microbe. 2015. 17:603-16.
• 10. Mueller, U. G. Engineering microbiomes to improve plant and animal health / U. G. Mueller, J L. Sachs // Trends Microbiol. 2015. 23:606-17.
• 11. Suchodolski, J. S. Intestinal Microbiota of Dogs and Cats: a Bigger World than We Thought / J. S. Suchodolski // Vet Clin Small Anim. 2011. 41:261-272.
• 12. Tarnecki, A. M. Fish intestinal microbiome: diversity and symbiosis unravelled by metagenomics / A. M. Tarnecki //J. AppL Microbiol. 2017.123:2-17.
• 13. Turrtbaugh, P. J. The human microbiome project / P. J. Turnbaugh // Nature. 2007; 449:804-10.
• 14. Wooley, J. C. A Primer on Metagenomics / J. C. Wooley, A. Godzik, I. Friedberg // PLoS Comput Biol. 2010. 6(2):el000667. URL: https://doi. org/10.1371/journal.pcbi.l000667.

Тема 3 БИОПЛЕНКИ.