Методы молекулярной биологии

Молекулярная биология использует широкий арсенал биологических, физических и химических методов, одни из которых достались ей «в наследство» от наук-предшественниц (биохимии, цитологии, генетики и др.), а другие были созданы в процессе ее собственного развития специально для работы с молекулярными объектами. Ниже приведен перечень ряда наиболее широко используемых методов и отмечены области их применения.

Микроскопия имеет давнюю историю, начиная с XVII в., когда в 1611 г. Й. Кеплер предложил принцип создания светового микроскопа, а А. Левенгук впервые наблюдал с его помощью одноклеточные бактерии (1638). Именно световая микроскопия, имеющая предел разрешения О,А—0,7 мкм, позволила М. Шлейдену и Т. Шва- ну в 1838 г. создать клеточную теорию, согласно которой клетка, содержащая ядро, является структурной и функциональной единицей строения всех животных и растений. Затем Р. А. Колликер впервые в 1857 г. описал митохондрии, а В. Флемминг — поведение хромосом при митозе.

В развитии микроскопии существенными вехами стали изобретения интерференционного (1930), фазово-контрастного (1932) и, наконец, электронного микроскопов (1939).

Электронная микроскопия, позволяющая обычно различать объекты размером около 20 А (2 нм) и имеющая в наиболее современных моделях электронных микроскопов предел разрешения до 0,1 нм, нашла самое широкое применение для изучения структур вирусов, внутриклеточных органелл, белково-нуклеиновых комплексов (хроматин, рибосомы, информосомы) и отдельных белковых молекул. Один из вариантов этого метода — криоэлектронная микроскопия — является в настоящее время ведущим при изучении тонкой структуры рибосом.

Наиболее впечатляющие и информативные трехмерные (объемные) изображения клеточных структур позволяют получить сканирующие электронные микроскопы (рис. 1.1).

Рентгеноструктурный анализ основан на дифракции рентгеновских лучей (электромагнитного излучения с длиной волны около Ю-10 м); позволяет выявить трехмерное расположение атомов в молекулах (разрешение составляет менее 0,1 нм). Метод был разработай в Англии Г. Брэггом и Л. Брэггом, и именно с его помощью были получены основополагающие сведения о структуре молекул белков, ДНК и РНК.

Примеры изображений, получаемых методом электронной микроскопии

Рис. 1.1. Примеры изображений, получаемых методом электронной микроскопии:

а — электронная микрофотография фаговых частиц (х200 000).

Слева направо: фаг фХ174, имеющий форму икосаэдра, вирус табачной мозаики (палочкообразная частица) и фаг Т4; б — полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа фотография полиморфноядерного

лейкоцита, поглощающего посредством фагоцитоза дрожжевую клетку

В наше время этот метод в сочетании с компьютерным анализом полученных данных является ведущим для изучения трехмерной структуры биополимеров.

Радиоактивные изотопы широко используются для изучения нуклеиновых кислот, белков, углеводов и других молекул в живой клетке. Радиоизотопы нестабильны и подвержены спонтанному распаду, при котором либо высвобождаются заряженные частицы — электроны, либо происходит гамма-излучение. Период полураспада варьирует от короткого, как, например, у изотопа 32Р (14 сут), до очень протяженного, как у 14С (5570 лет). Электроны определяют по ионизации газа в сцинцилляционном счетчике или счетчике Гейгера, либо методом радиоавтографии (по их воздействию на серебро, содержащееся в чувствительном фотоэмульсионном слое).

Радиоактивные молекулы используются при изучении самых разнообразных внутриклеточных процессов: синтеза молекул из их предшественников, определения внутриклеточной локализации молекул, времени их функционирования в клетке и ее отдельных компартментах, химических превращениях в отдельных участках макромолекул и т. д. Если, например, инкубировать клетки с радиоактивным предшественником РНК (3Н-уридином), то можно определить, что РНК синтезируется в ядре, а затем переходит в цитоплазму клеток. Радиоактивную метку можно вводить в изучаемые молекулы с помощью ферментов. Так, с использованием фосфотрансфераз и нуклеотидилтрансфераз можно вводить метку в белки, углеводы и нуклеиновые кислоты, используя для этого различные радиоактивные формы АТР (рис. 1.2).

Три радиоактивные формы АТР

Рис 1.2. Три радиоактивные формы АТР:

радиоактивные атомы выделены жирным шрифтом; приведены обозначения, указывающие расположение и тип радиоактивных атомов

В настоящее время наряду с радиоактивными метками все чаще и практически уже повсеместно используют флюорофоры — органические молекулы, поглощающие и излучающие поглощенную энергию в виде светового излучения характерной длины волны (цвета). Эту энергию, так же, как и радиоактивную, можно накапливать на фотоприемнике, причем для этого не требуется длительная экспозиция, но кроме того, ее можно регулировать путем изменения интенсивности падающего на флюорофор света. А еще можно одновременно и дифференцированно детектировать излучение сразу нескольких флюорофоров, различающихся по характерной для них длине волны (цвету) путем использования соответствующих светофильтров. Все эти преимущества, а также отсутствие вредного для организма радиоактивного излучения делает флуоресцентную детекцию довольно прогрессивным направлением развития методик, требующих визуализации молекулярных и субклеточных процессов.

Ультрацентрифугирование (седиментационный анализ) получило широкое распространение после изобретения в 1926 г. Т. Сведбергом аналитической ультрацентрифуги, с помощью которой он впервые определил молекулярную массу гемоглобина (68 кДа). В этом методе скорость седиментации (осаждения) определяется размером и формой разделяемых компонентов и выражается коэффициентом седиментации S. Коэффициент седиментации измеряется в секундах и определяется по формуле: (dx/dt)/со2х, где х — расстояние от центра вращения (радиус ротора центрифуги (см), определяемый от оси вращения до дна центрифужной пробирки); dx/dt — скорость седиментации (см/с); ш — угловая скорость вращения ротора (рад/с). Коэффициенты седиментации обычно представляют собой очень малые значения и поэтому выражаются в единицах Сведберга (S): 1 S = 1-10-13 с. Коэффициент седиментации молекулы гемоглобина составляет 4,5 S, молекулы тРНК — 4 S, рибосомы кишечной палочки — 70 S, лизосомы — 9400 S.

В 40—50-е гг. XX в. А. Клод и Ж. Браше разработали метод дифференциального центрифугирования для разделения органелл клетки, с помощью которого де Дюв (de Duve) в 1953 г. впервые выделил лизосомы, а затем — пероксисомы. В 1957 г. М. Месельсон, У. Сталь и Дж. Виноград разработали метод центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия для разделения нуклеиновых кислот, с помощью которого было установлено, что репликация ДНК осуществляется полуконсервативным путем (см. тему 7). Различные варианты метода ультрацентрифугирования широко используют в молекулярно-биологических исследованиях для выделения внутриклеточных компонентов и макромолекул (нуклеиновых кислот и белков), а также определения их молекулярных масс и коэффициентов седиментации.

Для более тонкого фракционирования и очистки разнообразных молекул, и прежде всего белков, в настоящее время применяется большая группа разнообразных физико-химических методов. Рассмотрим только наиболее широко распространенные методы фракционирования белков: хроматографию, электрофорез и изоэлектрофокусирование. Методы исследования структуры и функций нуклеиновых кислот изложены в последующих темах.

Хроматография — метод, впервые изобретенный русским ученым М. С. Цветом, который в 1906 г. фракционировал окрашенные экстракты листьев растений на колонках с порошком мела.

В настоящее время существует большое количество вариантов хроматографии, в которых используют матриксы (носители) разных типов, позволяющие разделить белки по заряду (ионообменная хроматография), размеру молекул (гель-хроматография, чаще называемая гель-фильтрацией) или способности специфически взаимодействовать с определенными химическими группами веществ, предварительно связанных с матриксом (аффинная хроматография). Из всех вариантов хроматографии наибольшей эффективностью обладает аффинная хроматография (хроматография по сродству), в основе которой лежит специфическое взаимодействие (узнавание) молекул взаимодействующих веществ. Например, предварительно связав с матриксом субстрат фермента, можно добиться избирательного удерживания фермента на колонке, а затем после выхода остальных («балластных») белков элюировать его в практически гомогенном состоянии. Матрикс можно оснастить и специфическими антителами и использовать такой носитель для выделения белков, распознаваемых этими антителами. Связав с матриксом фрагменты ДНК, можно выделить белки, специфически связываемые с определенными участками хромосом.

Широкое распространение получила также высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC). В этом методе используются специально разработанные кремнийорганические смолы, способные образовывать гомогенную среду в форме микросфер диаметром 3—10 мкм и позволяющие при высоком давлении осуществить быстрое равномерное протекание растворителя через колонку, при котором весь процесс хроматографии занимает считанные минуты и обеспечивает тонкое фракционирование смеси анализируемых молекул.

Электрофорез — в основе этого метода лежит способность белков, обладающих определенным суммарным положительным или отрицательным зарядом, перемещаться в электрическом поле в соответствии с величиной заряда, размером и формой молекул. Электрофорез можно проводить в водном (буферном) растворе, однако, как правило, его проводят в каком-либо пористом (полимерном) носителе: крахмальном, агарозном или полиакриламидном геле, на целлюлозных или нитроцеллюлозных пластинах и т. д.

Простейший метод электрофореза на пластинах целлюлозы был использован В. Ингрэмом в 1956 г. при фракционировании фрагментов протеолитического расщепления гемоглобина человека, полученных в результате обработки этого белка трипсином. С помощью данного метода были получены пептидные карты — «фин- герпринты» (отпечатки пальцев), по которым было установлено, что заболевание серповидноклеточной анемией обусловлено заменой одной-единственной аминокислоты в (3-цепи гемоглобина.

Наиболее часто в настоящее время для разделения белков используют метод электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), который представляет собой инертный матрикс с высоким и контролируемым числом поперечных сшивок. Варьируя размеры гелевых пор, можно фракционировать белки, существенно отличающиеся по молекулярной массе (от нескольких десятков тысяч до сотен тысяч дальтон). Метод был разработан в 1959 г. С. Рэймондом, а затем усовершенствован Б. Дэвисом и Л. Орнстейном. Он позволяет осуществить тонкое фракционирование смесей белков, отличающихся по заряду и молекулярной массе. Дальнейшей модификацией этого метода стал электрофорез в ПААГ с додецилсулъфатом натрия, предложенный в 1966 г. Дж. Майзелем. Додецилсульфат натрия (ДСН, SDS, ДС-Na) представляет собой мощный ионный детергент, который вызывает разворачивание белковых молекул в вытянутые цепи и сообщает им избыточный отрицательный заряд (рис. 1.3, а). Потерявшие нативную форму белки в таком (денатурирующем) геле перемещаются к положительно заряженному электроду (аноду) со скоростью, которая детерминируется только размером (массой) их полипептидных цепей. При этом гель, выступая в роли молекулярного сита, легче пропускает некрупные полипептиды и в большей мере тормозит продвижение более крупных молекул, тем самым разделяя белки в соответствии с их молекулярными массами (рис. 1.3, б). При электрофорезе с SDS обычно используют также обработку белков (3-меркаптоэтанолом, разрывающим (восстанавливающим) дисульфидные связи между субъединицами белков, что позволяет определить число и массу субъединиц в белках-мультимерах. После электрофореза белки выявляют либо красителем Ку- масси, либо серебрением (минорные белки), что позволяет выявить на электрофореграммах ничтожные количества (около 10 нг) белка.

В начале 70-х гг. XX в. в Швеции был разработан новый метод разделения белков в электрическом поле, получивший название изоэлектрофокусирования. В отличие от метода электрофореза, в процессе которого белки фракционируют при каком-то определенном значении pH, задаваемом электрофоретическим буферным раствором, при изоэлектрофокусировании белки разделяют

Электрофорез белков с додецилсульфатом натрия

Рис. 13. Электрофорез белков с додецилсульфатом натрия:

а — обработка белков ДСН и (3-меркаптоэтанолом, приводящая к разрыву ковалентных (дисульфидных) связей между отдельными полипептидными цепями, вызывающая разворачивание белковых глобул и сообщающая им избыточный отрицательный заряд (при электрофорезе такие денатурированные белки перемещаются к аноду со скоростью, обратно пропорциональной размеру (массе) их полипсптидных цепей); б — электрофореграмма, полученная в результате фракционирования растворимых белков листьев различных видов картофеля методом электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН: 1—9 — различные сорта картофеля; М — маркеры молекулярной массы

в градиенте pH, создаваемом с помощью специальных реагентов (амфолинов). В процессе изоэлектрофокусирования белки передвигаются в электрическом поле в строгом соответствии только с зарядом молекул и останавливаются (фокусируются) в тех точках градиента pH, которые соответствуют их изоэлектрическим точкам (pi), т. е. там, где молекулы становятся электронейтральными (рис. 1.4). Изоэлектрофокусирование позволяет не только исключительно тонко разделить белки по заряду (разделяются белки, отличающиеся по р/ всего на 0,005 единиц pH), но и быстро и точно определить их изоэлектрические точки.

Разработанное в 1975 г. П. Офареллом сочетание методов изоэлектрофокусирования и электрофореза в ПААТ с SDS получило название двумерного электрофореза. В этой процедуре белки вначале обрабатывают р-меркаптоэтанолом и мочевиной, что приводит к их полному растворению, денатурации и диссоциации полипеп- тидных цепей без изменения заряда. Далее проводят изоэлектрофокусирование в ПААГ, разделяя белки по заряду, а затем (в перпендикулярном направлении) ведут их электрофорез в блоке ПААГ с SDS, при котором белки разделяются по молекулярной массе. Таким образом, сочетая тонкое разделение вначале по заряду, а затем по размеру (массе), удается за один раз разделить до 2000 полипептидных цепей, т. е. проанализировать большинство всех белков бактериальной клетки (рис. 1.5).

Разделение белков методом изоэлектрофокусирования

Рис. 1.4. Разделение белков методом изоэлектрофокусирования:

при низких значениях pH белки заряжены положительно (+), при высоких значениях pH — отрицательно (-). В электрическом поле молекулы белков мигрируют к противоположно заряженным полюсам и останавливаются в тех точках градиента pH, которые соответствуют их изоэлектрическим точкам (pi). Изоэлектрические точки белка 1 и белка 2 находятся при pH 6,0 и 8,0 соответственно

Радиоавтограмма, иллюстрирующая результат разделения белков кишечной палочки с включенными в них С-аминокислотами методом двумерного электрофореза

Рис. 1.5. Радиоавтограмма, иллюстрирующая результат разделения белков кишечной палочки с включенными в них 14С-аминокислотами методом двумерного электрофореза:

на радиоавтограмме, полученной наложением на пластину полиакриламидного геля фотографической пленки, можно различить свыше

1000 пятен, соответствующих отдельным полипептидным цепям белков

Культура клеток — этот метод берет начало с 1885 г., когда впервые было обнаружено, что клетки куриного эмбриона сохраняют жизнеспособность в солевом растворе. С 1907 г. стали использовать культуры фрагментов тканей (эксплантантов). В настоящее время используют диссоциированные культуры клеток, из которых можно получить клетки одного типа. Иногда в культуре клеток появляются мутанты, которые могут бесконечно размножаться и образовывать клеточную линию. В отличие от раковых клеток, также способных к непрерывному делению, мутантные клетки лучше растут в контакте с какой-то поверхностью. Клеточные линии служат источником большого количества клеток одного типа и к тому же могут храниться при -70 °С неопределенно долго, не теряя способности к пролиферации. Наиболее часто используются клеточные линии фибробластов мышей и хомячков, а также эпителиальные клетки человека. В 1952 г. была получена перевиваемая до сих пор линия клеток карциномы шейки матки человека, широко известная как линия HeLa.

Однородность клеточных линий можно повысить путем клонирования. Клон — это популяция клеток, происходящая от одной клетки-предшественницы. С помощью клонирования выделяют мутантные клеточные линии, у которых мутация затронула определенные гены. Такие клетки бывают нередко дефектны по какому- то определенному белку, что позволяет проанализировать его функцию в нормальных клетках.

Слиянием двух клеток могут быть получены гетерокарионы — клетки с двумя отдельными ядрами. После митотического деления гетерокарион превращается в гибридную клетку, у которой все хромосомы объединяются в одном ядре. Такие гибридные клетки дают возможность изучать функции отдельных хромосом, взаимодействие внутриклеточных компонентов (митохондрий, ядер и др.) различных клеток. Их можно клонировать и получить гибридную клеточную линию. Существенно, что гибридные клетки нестабильны. В частности, гибридные клетки человек-мышь постепенно утрачивают хромосомы человека, что позволяет судить о функциях отдельных хромосом, осуществляя таким образом их генетическое картирование.

Бесклеточные системы — незаменимы для изучения механизмов определенных молекулярных процессов, так как исключают различные побочные реакции, протекающие в клетке. В 1954 г. П. Замечник получил первую бесклеточную систему для изучения биосинтеза белка (трансляции). Возможности этих систем были далее блестяще использованы А. С. Спириным, М. Номурой и другими исследователями для изучения деталей трансляции. При этом из экстрактов клеток выделяли важнейшие компоненты белок-син- тезирующей системы (мРНК, рибосомы, тРНК и др.), а затем последовательно вводили их в систему и уточняли роль каждого компонента в биосинтезе белка. С помощью бесклеточных систем был расшифрован генетический код, для чего в качестве мРНК использовали синтетические олиго- и полинуклеотиды известного состава. Бесклеточные системы используются также для изучения деталей других важнейших молекулярно-генетических процессов: репликации и транскрипции ДНК, сплайсинга РНК и др.

Моноклональные антитела — очень чувствительный инструмент выявления (идентификации) молекул в сложных смесях, и поэтому они находят очень широкое применение в молекулярной биологии. Антитела в целом представляют собой белки (иммуноглобулины), вырабатываемые позвоночными животными для защиты от чужеродных соединений — антигенов. Клетки позвоночных животных способны синтезировать колоссальное количество (108) различных форм антител, отличающихся участками узнавания антигенов. Именно высокая специфичность антител определяет их уникальные возможности для выявления различных молекул в клетке. Разработанный в 1976 г. метод включает клонирование В-лимфоцитов, секретирующих только определенный вид антител, благодаря чему эти антитела можно получать в больших количествах. Но время жизни В-лимфоцитов в культуре невелико, поэтому проводят их слияние с клетками, происходящими от «бессмертной» опухоли, также полученной из В-лимфоцитов. Из образовавшейся смеси клеток отбирают гибриды, способные развиваться в культуре и синтезировать антитела определенного вида. Эти гибридные клетки называют гибрид омами. Их клонируют по отдельности и получают клоны, каждый из которых является источником моноклональных антител. Моноклональные антитела происходят от одной- единственной клетки и обладают абсолютной специфичностью к белкам: они способны узнавать определенную конфигурацию группы из 5—6 аминокислотных остатков. Каждый тип антител можно далее использовать в качестве зонда для определения локализации белка в клетке и для очистки белков в аффинной хроматографии. В недалеком будущем моноклональные антитела могут стать источником для создания новой группы каталитически активных молекул — абзимов (см. тему 2).

Каталитически активные белки (ферменты) — важнейшие инструменты биохимических методов исследования. Они нашли широкое применение в молекулярной биологии и конкретные примеры их использования равно как и других катализаторов биологической природы (рибозимов, абзимов, гибридозимов) будут приведены в последующих темах.

Многие из представленных здесь методов исследования белков и нуклеиновых кислот вошли в цикл практических работ, составивших отдельное издание — «Молекулярная биология. Практикум». Этот практический курс поможет не только более глубоко освоить сущность и приемы реализации методов, но структурировать информацию о них, а также научит принципам планирования молекулярно-биологических экспериментов.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >