Гибридизация нуклеиновых кислот

Метод основан на способности азотистых оснований образовывать комплементарные пары: А-Т (U) и G-С. Реакция гибридизации используется в генетической инженерии для создания гибридных молекул ДНК, а также как весьма чувствительный метод выявления определенных последовательностей в ДНК и РНК. Если водный раствор ДНК нагреть до температуры 96—100 °С и сильно защелочить (pH > 13,0), то ДНК диссоциирует на отдельные цепи. Этот процесс денатурации ДНК обратим, поскольку если две изолированные цепи ДНК выдерживать определенное время при 65 °С, то они вновь спариваются, образуя двойную спираль, — что и называют ренатурацией, или гибридизацией (отжигом). Гибридизация может идти между одинарными цепями ДНК и (или) РНК (конечно, если они имеют комплементарные последовательности нуклеотидов), что приводит к образованию двойных цепей (дуплексов) разного состава: ДНК : ДНК; РНК : РНК; ДНК : РНК.

При конструировании гибридных ДНК гибридизация нуклеиновых кислот реализуется, как правило, в двух основных стратегиях (методах) получения рекомбинантных ДНК: коннекторном и ре- стриктазно-лигазном.

Коннекторный метод создает условия для гибридизации продуктов рестрикции разных геномов путем наращивания на их концах комплементарных олигонуклеотидных участков (рис. 14.2). Гибридизация (отжиг) этих фрагментов ведет к образованию гибридных молекул ДНК. В этом методе используются 3 фермента: 5'-эк- зонуклеаза, терминальная нуклеотидилтрансфераза и ДНК-лигаза. Именно этим методом П. Берг и сотр. получили в 1972 г. первую гибридную молекулу ДНК.

Схема коннекторного метода получения гибридных молекул ДНК (по С. Н. Щелкунову, 1994)

Рис. 14.2. Схема коннекторного метода получения гибридных молекул ДНК (по С. Н. Щелкунову, 1994)

Рестриктазно-лигазный метод, разработанный Коэном и сотр. в 1973 г., наиболее прост и популярен в генетической инженерии. В этом методе с использованием одной рестриктазы типа II, дающей фрагменты рестрикции с «липкими концами», гибридизация между фрагментами хромосомной ДНК и ДНК-плазмидой осуществляется без дополнительной процедуры наращивания комплементарных концов. После окончания гибридизации остается только сшить по- линуклеотидные фрагменты с помощью ДНК-лигазы (рис. 14.3).

Гибридизация используется для нахождения числа определенных нуклеотидных последовательностей (генов) в ДНК. Для этой цели применяют ДНК-зонды — радиоактивные фрагменты ДНК с известной нуклеотидной последовательностью. Метку в зонд вводят путем ник-трансляции (см. выше). Поскольку скорость ренатурации (гибридизации) денатурированной нагреванием ДНК лимитируется вероятностью столкновения комплементарных последовательностей, скорость гибридизации с ДНК-зондом дает возможность определить число копий генов в ДНК. Это очень точный метод, который позволяет выявить один-единственный ген в клетке. Так выявляют отдельные (уникальные) гены, а также гены, представленные в геноме десятками или сотнями копий.

В настоящее время для подготовки синтетических зондов (за исключением молекул ДНК или РНК, используемых в качестве зондов, но выделенных из живого организма) вместо радиоактивных используют флуоресцентные метки — молекулы флюоресцирующих красителей, введенные в состав зонда путем образования ковалентной связи с ОН-группой рибозы или дезоксирибозы чаще всего концевого нуклеотида. Более подробно обнаружение определенной последовательности ДНК-мишени методом гибридизации с флуоресцентно-меченым зондом расмотрено в Практической работе № 11 в издании Молекулярная биология. Практикум.

Для локализации специфичных последовательностей нуклеиновых кислот в хромосомах и клетках используют гибридизацию in situ. ДНК-зонды при этом гибридизуют с хромосомами после кратковременного воздействия щелочного pH. Далее места гибридизации выявляют с помощью радиоавтографии. При этом используют не только радиоактивные, но и так называемые биотинилированные ДНК-зонды.

Схема рестриктазно-лигазного метода получения гибридных молекул ДНК

Рис. 14.3. Схема рестриктазно-лигазного метода получения гибридных молекул ДНК

Для этого при синтезе зонда используют нуклеотиды, содержащие боковую цепь биотина, которую после гибридизации окрашивают стрептовидином. С помощью гибридизации in situ можно выявить локализацию определенных видов мРНК в клетках и таким образом судить о дифференциальной активности генов в эмбриогенезе и процессе дифференцировки в клетках эмбриона. Популярной биологической моделью таких исследований являются эмбрионы плодовой мушки дрозофилы.

Гибридизация используется для выявления транскрибируемых и нетранскрибируемых последовательностей в ДНК. При этом анализируются продукты гибридизации ДНК и матричных РНК, что позволяет выявить активные (транскрибируемые) участки в молекулах ДНК. Именно анализ результатов гибридизации ДНК: РНК позволил У. Гилберту выявить мозаичное строение генов эукариот (см. тему 6), что стало одним из крупнейших открытий в молекулярной биологии.

При высоком числе генов у эукариот (от 6200 у дрожжей до 30 000 и более у человека) возникает необходимость в использовании специальной техники для одновременного получения экспериментальной информации об активности большого числа генов в клетке.

Современная экспериментальная техника позволяет создать матрицу — биочип, размером всего несколько сантиметров, с помощью которой можно получить данные о функциональной активности многих (если не всех) генов организма. В этом методе на специальную (стеклянную) подложку с помощью роботов наносят образцы ДНК, которые представляют собой либо отдельные гены, либо молекулы кДНК, полученные в достаточном для приготовления биочипов количестве с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). После иммобилизации ДНК на матрице с помощью ультрафиолета проводят гибридизацию содержащихся на чипах генов с образующимися РНК, выделяемыми из изучаемого объекта. Для анализа результатов гибридизации используют флуоресцентные красители. После того как флуоресцирующие образцы РНК прореагировали с биочипом, чип сканируют лазером и оценивают интенсивность сигнала флуоресценции, служащей мерой функциональной активности генов. Использование биочипов перспективно в разных направлениях, и в частности для выявления генов, реагирующих на негативное (стрессовое) воздействие окружающей среды и осуществляющих защитные функции в организме. Так, с помощью биочипов подтверждена выдающаяся роль гена, кодирующего белок р-53, в защите организма от разнообразных повреждающих реагентов (подробнее об этом белке см. в теме 13).

Гибридизация широко используется для выявления определенных нуклеотидных последовательностей в смеси рестрикционных фрагментов. Такой прием носит название «блоттинг» (от англ, blot — промокать). С этой целью рестрикционные фрагменты фракционируют методом электрофореза в 0,8%-ной агарозе, что позволяет разделить до 500 фрагментов, отличающихся по размеру всего на один нуклеотид. Затем гель совмещают с листом нитроцеллюлозной бумаги. В результате диффузии фрагменты частично переходят на этот лист (blot), и таким образом получается реплика (отпечаток) с геля. Затем методом радиоавтографии с использованием радиоактивного ДНК-зонда и рентгеновской пленки определяют на реплике положение фрагментов, которые гибридизуются с зондом. Такой прием выявления фрагментов ДНК с использованием ДНК-зондов, приводящий к образованию гибридов ДНК-ДНК, носит название саузерн-блоттинг.

Нозерн-блоттингом называют процедуру, при которой ДНК- зонды гибридизуют с репликами геля, в котором фракционируют РНК, что приводит к образованию гибридов ДНК-РНК.

Гибридизацию (блоттинг) зондов можно осуществлять и в отношении целых хромосом, которые удается фракционировать в крупнопористых агарозных гелях методом пулъс-электрофореза, меняя направление электрического поля, что позволяет фракционировать огромные молекулы ДНК.

Способность ДНК к денатурации-ренатурации используется и в одном из самых распространенных в настоящее время методов амплификации фрагментов ДНК in vitro — полимеразной цепной реакции.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >