Полимеразная цепная реакция и другие методы амплификации нуклеиновых кислот

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод амплификации фрагментов нуклеиновых кислот in vitro, с помощью которого можно достаточно быстро (в течение нескольких часов) получить миллионы копий определенных нуклеотидных последовательностей (генов). Метод был предложен в 1985 г. К. Мюллисом (биотехнологическая корпорация Cetus, США) и получил широкое распространение с 1988 г., когда Р. Сайки с соавт. была опубликована основополагающая работа по теории ПЦР и ее оптимизации. Метод ПЦР, названный «изобретением века» и очень скоро, в 1993 г., отмеченный Нобелевской премией, ускорил реализацию программы «Геном человека» (см. тему 6), а также способствовал внедрению в практику клинической диагностики многих заболеваний высокоэффективных диагностических наборов нового поколения.

В методе ПЦР для амплификации фрагментов ДНК используют термоустойчивую ДНК-полимеразу из термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq-полимеразу), которая в присутствии всех 4 видов дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и коротких 20—30-членных затравок (праймеров) осуществляет синтез комплементарных последовательностей ДНК.

Вначале осуществляют термическую денатурацию (расплетание) двуцепочечной молекулы (фрагмента) ДНК при 93—95 °С, что приводит к разделению комплементарных цепей, а затем пробы охлаждают до 60 °С, что дает возможность связаться праймерам и одноцепочечным дезоксиолигонуклеотидам, а также запускает работу Taq-полимеразы.

Праймеры обычно получают методом химического синтеза, определив предварительно нуклеотидную последовательность пограничных с амплифицируемым геном участков ДНК. В менее строгом варианте, когда неизвестны пограничные участки генов, используют случайные праймеры, которые могут связываться с ДНК. Праймеры подстраиваются сами (по комплементарному принципу) к денатурированным нагреванием гомологичным участкам одноцепочечных фрагментов исходной («материнской») ДНК. Они служат по существу для двух целей: во-первых, запускают работу ДНК-полимеразы, а во-вторых, ограничивают ее действие, как бы застопоривают фермент в рамках нужного участка копирования ДНК (рис. 14.4).

Как видно из схемы, ПЦР имеет циклический характер. В первом и частично во втором циклах образующиеся копии (амплико- ны) ДНК не соответствуют границам амплифииируемого гена (все ампликоны в первом цикле и часть ампликонов во втором цикле получаются более протяженными в тех участках, где еще не произошло связывание второго — «антисмыслового» праймера). Однако начиная уже с третьего цикла длина ампликонов становится стандартной, т. е. соответствует числу пар нуклеотидов фрагментов ДНК-матрицы между З'-концами праймеров. Ампликоны накапливаются в геометрической прогрессии и начинают доминировать среди продуктов амплификации. Процесс имеет цепной характер, так как синтезированные фрагменты ДНК в дальнейшем сами служат матрицей, на которой идет синтез.

При многократном повторении циклов синтеза (включающих нагревание и охлаждение проб в вышеназванных пределах температур) число копий специфических фрагментов ДНК экспоненциально увеличивается, что позволяет из небольшого числа имеющихся фрагментов получить большое количество копий, которые можно идентифицировать методом электрофореза.

Повторяя циклы амплификации 30—40 раз, за 1,5—3 ч получают миллиарды копий фрагментов ДНК. Увеличение числа циклов неэффективно, так как ПЦР имеет экспоненциальный характер только на начальных этапах (20—25 циклов), после чего начинается выход на плато в силу истощения дезоксирибонуклеозидтрифос- фатов, праймеров и нарастающего температурного повреждения Taq-полимеразы. Тем не менее результаты, достигаемые с помощью ПЦР, позволили этому методу занять ведущее место в молекулярной биологии как по популярности использования в научных исследованиях фундаментального характера, так и по практическому применению в медицинских целях. В частности, этим методом удалось

Схема полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Рис. 14.4. Схема полимеразной цепной реакции (ПЦР):

а — результаты амплификации одной копии гена из геномной библиотеки человека методом ПЦР с использованием Taq-полимеразы; б — фотография пластины агарозного геля после электрофореза и проявления продуктов амплификации. М — маркеры размеров фрагментов ДНК. Размер амплифицированного гена 960 н. п. (Innis М. A. et al. PCR Protocols and Applications: A Laboratory Manuals. — Academic. New York, 1989.) получить продукты амплификации из одной-единственной копии матричной последовательности гена глобина человека и из уникальных генов одного сперматозоида.

Более подробно метод ПЦР, его оптимизация и применение для генетической инженерии рассмотрено в Практической работе № 6 издания Молекулярная биология. Практикум.

Метод ПЦР быстро прогрессирует, создаются его новые разновидности, нацеленные на решение конкретных задач. Ниже приведены краткие сведения по нескольким видам ПЦР.

ПЦР с обратной транскрипцией (англ. Reverse Transcription PCR, RT-PCR) используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы и получают одноцепочечную кДНК, которая используется в качестве магрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены.

Асимметричная ПЦР (англ. Asymmetric PCR) проводится, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и ги- бридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке.

Количественная ПЦР, ПЦР в реальном времени (англ. Quantitative real-time PCR). В этом методе используют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления. Судя по тому, насколько быстро продукт накапливется в реакционной смеси, делают вывод о большем или меньшем количестве ДНК-матрицы, вступившей в ПЦР. Для точного определения этого количества требуется построить калибровочную кривую с использованием матричной ДНК, для которой можно легко установить молярную концентрацию (как правило это короткие амплифицированные фрагменты ДНК или рекомбинантные плаз- мидные ДНК, в состав которых включен целевой фрагмент).

Цифровая ПЦР — разновидность количественной ПЦР, в которой матричную ДНК вносят в реакционную смесь в предельном разведении, настолько значительном, чтобы аликвота такого раствора содержала или только одну единственную молекулу ДНК-матрицы, или не содержала ее вовсе. В первом случае будет получен продукт ПЦР, т. е. реакция положительна, во втором — нет, т. е. реакция отрицательна. По числу положительных и отрицательных реакций по результатам постановки их в большом количестве одновременно (100 и более) с одной и той же сильно разбавленной матрицей можно точно рассчитать концентрацию искомой ДНК статистическими методами. В современном исполнении цифровая ПЦР реализуется в микрокомпартаментах (микрореакторах) на поверхности специального чипа, детекция продуктов ПЦР осуществляется в реальном времени, а все необходимые расчеты производятся автоматически в соответствии с поставленной задачей. Помимо количественного определения ДНК цифровая ПЦР применяется для обнаружения редких мутаций (от 0,025 % до 0,01 % представленности в образце), определения вариаций числа копий гена в геноме, обнаружение химеризма, определения уровня экспрессии генов, кодирующих белки и малые некодирующие РНК, точного установления вирусной нагрузки.

Touchdown (Stepdown) ПЦР. С помощью этого метода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров на образование продукта. Первые циклы проводят при температуре выше температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру снижают. При определенной температуре система пройдет через полосу оптимальной специфичности праймеров к ДНК.

Метод молекулярных колоний — ПЦР в толще акриламидного геля, в который заранее вносят все необходимые для ПЦР компоненты, а матричную ДНК распределяют по поверхности, перенося ее с другого геля (после электрофореза, например), отпечатка поверхности чашки Петри, заселенной колониями микроорганизмов или другим способом, и проводят ПЦР. Поскольку амплификация ДНК происходит в геле, потомство каждой молекулы образует точечную колонию, а не распространяется по всему объему. Таким образом, отдельную молекулу можно размножить до детектируемого числа идентичных молекул, что дает возможность выявить, идентифицировать и подсчитать единичные молекулы, а выделив полученный молекулярный клон из геля, секвенировать его или использовать для генно-инженерных работ.

В отдельных видах ПЦР кроме «классической» Taq-полимеразы используются и другие термостабильные ДНК-полимеразы, несколько отличающиеся по свойствам. Так, например, Vent ДНК-полимеразы из Thermococcus litoralis и Pfu ДНК-полимеразы из Pyrococcus furiosus, отличающиеся высокой точностью копирования амплифицируемых участков ДНК, и Taq SE ДНК-полимеразы пригодны для амплификации особо протяженных участков ДНК (до 15 тыс. н. п.).

Лигазная цепная реакция проводится по принципу, аналогичному ПЦР, но вместо Taq-полимеразы и dNTP используется термостабильная ДНК-лигаза и четыре специфических олигонуклеотида, добавляемых в реакционную смесь в избытке. Каждые 2 олигонуклеотида комплементарны к амплифицируемому фрагменту ДНК- матрицы и непосредственно примыкают друг к другу; одновременно они комплементарны и другой паре олигонуклеотидов. После денатурации ДНК-матрицы при 95 °С олигонуклеотиды связываются с соответствующими (комплементарными) фрагментами цепей ДНК-матрицы и сшиваются лигазой при 50 °С. Далее эти две стадии цикла повторяются много раз, в результате чего экспоненциально увеличивается число соединенных ковалентной связью олигонуклеотидов, и таким образом достигается амплификация определенных участков ДНК.

NASBA-метод (Nucleic Acid. Sequence-Based Amplification), разработанный в последние годы, является наиболее универсальным методом амплификации как ДНК, так и РНК. Этот метод, в отличие от ПЦР, является изотермальным и осуществляется при 41 °С. Основными компонентами NASBA-системы являются РНК-полимераза фага Т 7, РНКаза Н и обратная транскриптаза вируса птичьего миелобластоза (об этих ферментах см. выше). В систему входят также нуклеозидтрифосфаты и два специфических праймера, один из которых содержит участок, представляющий собой последовательность (промотор), распознаваемую РНК-полимеразой. В качестве матриц могут быть использованы и двуцепочечные нуклеиновые кислоты, но после превращения их в одноцепочечные. NASBA-метод применяется для диагностики инфекционных заболеваний, генетических дефектов, диагностики и контроля терапии рака. Чувствительность NASBA при тестировании ВИЧ составляет три копии (РНК) вируса иммунодефицита человека в 100 мкл образца плазмы крови. Метод можно использовать для контроля микробиологической безопасности пищевых продуктов, в ветеринарной диагностике и судебно-медицинской службе.

Петлевая изотермическая амплификация (англ, loop-mediated isothermal amplification, LAMP) предложена японским ученым Цугунори Нотоми в 2000 г. как метод амплификации ДНК с высокой специфичностью, эффективностью и быстротой (Notomi et al., Nucleic Acids Res, 2000). Реакция происходит в присутствии большого фрагмента Bst-ДНК полимеразы, выделенной из Bacillus stearothermophilis, и нескольких пар особым образом синтезированных олигонуклеотидных прамеров, которым принадлежит ключевая роль в протекании LAMP. Каждый из праймеров имеет два участка, комплементарных матричной ДНК, однако расположение этих участков на праймерах обратное по отношению к матрице. В результате при гибридизации с матричной ДНК своим З'-кон- цом, его 5'-конец оказывается свободным. Аналогичный праймер гибридизуется со второй цепью ДНК-матрицы. Еще две пары таких праймеров взаимодействуют с продуктами амплификации. После того как в ходе синтеза формируется новая копия матричной ДНК, праймеры из первой пары включаются в ее состав, а две пары новых гибридизуются уже с ними. В результате амплифицированная ДНК сворачивается в петли, которые удерживаются гомологичными участками праймеров, а синтез этой ДНК не прерывается, повторяясь каждый раз снова, проходя через петли гомологичных друг другу праймерных участков. Продукт LAMP — длинная молекула ДНК, состоящая из последовательно расположенных на ней прямых и обратных копий целевого фрагмента, которые перемежаются с петлеобразными праймерными участками.

Реализация данного метода возможна только при использовании большого фрагмента ДНК-полимеразы I — домена, обладающего 5'—3' ДНК-полимеразной активностью, но не имеющего экзонукле- азной активности, в отличии от холофермента ДНК-полимеразы. Как следствие, ДНК-полимераза не разрушает, а сталкивает (смещает) цепь ДНК, расположенную на матрице, потому термическая денатурация ДНК не требуется, а сама реакция протекает в изотермических условиях. Это преимущество исключает зависимость результата от точности работы термостата как для ПЦР, и в целом упрощает и удешевляет процедуру амплификации. Кроме того, Bst-ДНК полимераза в качестве матрицы использует как ДНК, так и РНК, поэтому при анализе РНК не требуется проводить обратную транскрипцию. К недостаткам метода следует отнести сложность детекции амплификации, которую осуществляют косвенно по факту выделения пирофосфата в ходе реакции, а также невозможность обнаружения нескольких целевых фрагментов ДНК при их одновременной амплификации, так как продукты LAMP невозможно различить. Тем не менее метод петлевой изотермической амплификации уже нашел применение в широкой практике для контроля микробиологической безопасности пищевых продуктов.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >