Адсорбция белков на поверхности водных растворов

Благодаря наличию на поверхности молекулы белка гидрофобных участков контакт этих участков с воздухом имеет меньшую свободную энергию, чем соседство с водным раствором. Поэтому молекулы белка накапливаются на границе раздела «раствор — воздух», образуя один или несколько слоев. Так как различные белки имеют разное соотношение полярных и неполярных участков на поверхности молекулы, различную геометрию их расположения, различающуюся способность молекул к взаимодействию в адсорбционных слоях, то параметры их адсорбции на границе с воздухом будут зависеть от вида белка.

Так, максимальная толщина адсорбционных слоев сильно различается для разных белков как показано в табл. 6.1. Толщина слоев в это этой таблице указана ориентировочно, так как в расчетах не учитывался коэффициент поглощения белковых пленок. Однако они позволяют сравнить пленки разных белков между собой.

Таблица 6.1

Толщина адсорбционных слоев, образуемых различными белками на границе раздела «водный раствор — воздух»

Белок

Массовая доля, %

рн

Метод измерения толщины

Толщина, мкм-10-1

Альбумин сывороточный человека

0,1

4,9

Эллипсометрия

4,5

/-казеин

Эллипсометрия

3,0—15,0

Лизоцим

0,4

7,0

Метод нарушенного полного внутреннего отражения

28

Однако существуют и общие для всех протеинов закономерности адсорбции.

Одним из наиболее информативных методов изучения адсорбции белков является измерение и анализ изотерм сорбции. Это зависимость величины адсорбции Г от концентрации белков в растворе. Величиной адсорбции называется масса белка, осаждающаяся на единице площади поверхности раствора. В качестве примера описания изотерм сорбции белков на границе раздела «раствор — воздух» можно привести исследование адсорбции а-химотрипсина, выполненное с использованием метода радиоактивных индикаторов (тритиевая метка).

Начальные участки изотермы при малых концентрацях (до концентрации (6^-7) • 10-8 моль/л) отвечают области действия закона Генри и могут быть описаны уравнением типа

где Ка константа адсорбционного равновесия адсорбат — адсорбент; Со — начальная концентрация белка в растворе,

Участок изотермы адсорбции при концентрациях белка в растворе С > 10 моль/л хорошо согласуется с эмпирическим уравнением

где и — число монослоев адсорбата.

При анализе изотерм сорбции а-химотрипсина была установлена полимолекулярность адсорбции белка на легкоподвижных границах, и в частности на границе раствора с воздухом1.

Перейдем к вопросу зависимости характеристик адсорбции от времени на начальных этапах формирования адсорбционных

Измайлова В. Н., Ямпольская Г. П., Сумм Б. Д. Поверхностные явления в белковых системах. М. : Химия, 1988.

слоев. Кроме зависимости величины адсорбции от времени при таких исследованиях часто изучают поверхностное натяжение, а также поверхностное давление растворов.

Поверхностным натяжением жидкости называется величина

где А — работа, которую нужно совершить, чтобы площадь поверхности увеличить на 5.

В положении равновесия свободная энергия системы минимальна, поэтому жидкость, предоставленная самой себе, стремится сократить свою поверхность. Мысленно ограничим какой-либо участок поверхностного слоя замкнутым контуром. В нем действуют силы, называемые силами поверхностного натяжения, направленные по касательной к поверхности перпендикулярно к участку контура, на который они действуют.

Коэффициент поверхностного натяжения о можно определить и как силу, приходящуюся на единицу длины контура, ограничивающего поверхность. Соответственно, поверхностное натяжение во многом определяется взаимодействием между молекулами, находящимися на поверхности жидкости: чем оно больше, тем больше поверхностное натяжение.

Двумерное или, что то же самое, поверхностное давление л численно равно снижению поверхностного натяжения раствора белка €Ур при данной концентрации по сравнению с поверхностным натяжением чистой воды сув:

Пусть на поверхности раствора находится слой адсорбированных молекул растворенного вещества. Тогда поверхностное натяжение о определяется взаимодействием уже не молекул растворителя, а молекул в адсорбированном слое, поэтому величина л изменяется.

Кинетика формирования белковых адсорбционных слоев на границе «раствор — воздух» определяется двумя стадиями — диффузионной и активационной. На первой стадии скорость адсорбции ограничена диффузией молекул белка из раствора к границе раздела.

В этом случае поверхностная концентрация молекул белка очень мала и монослой находится в состоянии идеального двумерного газа, для которого справедливо соотношение

где 5 — площадь поверхности, приходящейся на 1 моль адсорбированного вещества; Т — температура; К — универсальная газовая постоянная.

Это уравнение аналогично уравнению состояния для одного моля идеального газа

(в данном случае отношение массы к молярной массе равно едини-це, т. е. — = 1). Так как рассматривается двумерный идеальный газ, Ц

то величина поверхностного давления п — аналог обычного давления газа р а величина площади — аналог объема.

Временная зависимость накопления белка на границе раздела описывается уравнением нестационарной диффузии:

где Г — величина адсорбции; Со — начальная концентрация раствора белка; Р — коэффициент диффузии; т — время.

Учитывая, что 5 = р, из формул (6.5) и (6.6) получаем выражение, описывающее снижение поверхностного натяжения во времени:

Экспериментальные данные указывают на применимость уравнения (6.7) для описания начальной стадии адсорбции некоторых белков. Так, для растворов бычьего сывороточного альбумина в области концентраций от 0,5 ? 10~7 до 4,2 • НУ7 моль/л результаты измерения поверхностного натяжения в зависимости от времени в диапазоне времен 6—15 с хорошо совпадают с рассчитанными по уравнению (6.7).

Однако в той же области концентраций по мере дальнейшего снижения поверхностного натяжения во времени наблюдается расхождение результатов эксперимента и расчета.

Кинетические зависимости понижения поверхностного натяжения растворов фибриногена, построенные в координатах «л—7г» в области малых времен имеют прямолинейные участки. Интервал времен, при которых зависимость «л—71» прямолинейна, зависит от концентрации белка.

По мере снижения поверхностного натяжения диффузионная стадия адсорбции переходит в активационную. Эта стадия характеризуется значительным энергетическим барьером, замедляющим адсорбцию белков на поверхности. В этом случае скорость адсорбции лимитируется уже не константой скорости диффузии, а величиной энергетического барьера.

Скорость снижения поверхностного натяжения на этой стадии адсорбции выражается формулой, описывающей активационные процессы:

где Ко константа скорости снижения поверхностного натяжения не взаимодействующими между собой молекулами белка на полностью свободной поверхности (при степени заполнения, близкой к нулю); и — величина энергетического барьера адсорбции; к — постоянная Больцмана.

На уже частично занятой поверхности для включения новой молекулы белка в адсорбционный слой необходимо создать свободную поверхность А5. Работа по созданию этой поверхности выражается интегралом

При малых величинах А8 можно приближенно считать, что и — = л: А8.

Тогда для скорости снижения поверхностного натяжения при образовании адсорбционного слоя можно записать

Экспериментальные зависимости, построенные в координатах «1п———тг» для фабриногена и некоторых других белков, состоят с/т

из нескольких линейных участков с возрастающим наклоном, что означает увеличение энергетического барьера по мере заполнения поверхности белком. Наклон этих участков позволяет определить величину А8. Выяснилось, что величина А5, определенная на заключительных стадиях формирования адсорбционного слоя, гораздо меньше площади сечения белковой глобулы. Высказывается предположение, что величина А5 связана с изменением доступной для молекул воды поверхности молекул белка при переходе молекулы из раствора в адсорбционный слой. Это изменение происходит вследствие возникновения контакта с границей раздела фаз и контактов белок — белок. Это предположение подтверждается линейной зависимостью А8 от величины М2/3 (М — молекулярная масса белка), с наклоном 0,1, в то время как доступная поверхность белка равна 0,11м2/3.

Соотношение между стадиями диффузионного и «барьерного» контроля адсорбции может изменяться при изменении условий адсорбции, например если жидкость движется относительно пузырька, как это имеет место при флотации. Соответствующие эксперименты были проведены. Исследованы изотермы поверхностного натяжения о(г) растворов фибриногена, протекающих через измерительную ячейку с постоянной скоростью. Образование адсорбционного слоя белка на поверхности движущегося раствора и снижение су во времени вплоть до До = 84-10 мН/м описывается диффузионной стадией независимо от концентрации белка и температуры (в диапазоне 13—37 °C). В статических же условиях процесс диффузии перестает лимитировать адсорбцию уже при До = = мН/м.

При концентрации белков в растворе больше 10~7—10-6 моль/л описание адсорбции как последовательно протекающие диффузионная и «барьерная» стадии не соответствует действительности. В этом случае можно воспользоваться следующими соображениями[1].

Протеины на границе «воздух — жидкость» могут существовать в различных состояниях с удельной молекулярной поверхностной площадью от comin до сотах. Под удельной молекулярной поверхностной площадью здесь подразумевается выходящая на границе раздела «раствор — воздух» площадь поверхности молекул, содержащихся в единице массы адсорбционного слоя. Пусть со0 — удельная площади сегмента протеиновой молекулы, а число состояний п = = (“max “ “min)/“о» Т0ГДа удельная молекулярная поверхностная площадь в каждом состоянии определяется следующим образом:

Важно заметить, что соо эквивалентно молекулярной площади растворителя и много меньше, чем comin.

Если определить Г; как соответствующую величину адсорбции в состоянии i, то полную величину адсорбции и полную поверхностную площадь протеина можно найти по формулам

где со есть средняя удельная поверхностная молекулярная площадь, определяемая из формулы (6.13) как

Адсорбция протеина на границе «газ — жидкость» изменяет поверхностные свойства, которые могут быть определены через поверхностное давление:

где л — поверхностное давление; Е — универсальная газовая постоянная; Т — температура; а — параметр, характеризующий латеральные взаимодействия между адсорбированными молекулами.

Изотерма сорбции для каждого состояния протеина на границе раздела может быть определена из изотермы Фрумкина для нормальных поверхностно-активных веществ и описана соответствующим выражением:

где С$ — концентрация протеина в слое жидкости, примыкающем к границе раздела; Ь(- — равновесная константа адсорбции, которую можно в первом приближении считать одинаковой для всех состояний белка (Д- = Ь).

Для того чтобы найти С$, Г, со, требуется, кроме уравнений (6.15), (6.16), еще одно уравнение. Третье уравнение — это выражение, описывающее кинетику адсорбции. Для плоской границы раздела таким соотношением является уравнение Варда и Твардая (6.6), которое с учетом десорбции можно представить в виде

где Р — коэффициент диффузии протеина; Сь объемная концентрация; С — текущее время; т — переменная интегрирования. Два слагаемых в правой части уравнения (6.17) соответствуют процессам адсорбции и десорбции.

Для сферической границы раздела, каковой является поверхность газового пузырька, было предложено другое уравнение:

где К — радиус газового пузырька; Со = Сь начальная концентрация белка в растворе; Л — параметр.

В уравнении (6.18) первые два члена соответствуют адсорбционному процессу, а последние два слагаемых — десорбционному.

Преимуществом данного подхода является отказ от модели двумерного идеального газа, поэтому они могут применяться при значительно более высоких концентрациях, чем выражение (6.5). Так, показано, что соответствие расчетных и экспериментальных кривых л(0 для [3-казеина при концентрации 10-6 моль/л было лучше чем при концентрации 10-7 моль/л.

Кроме того, в уравнениях (6.14)—(6.16), положенных в основу модели, учтен факт поверхностных конформационных превращений, с которыми связывают наличие энергетического барьера адсорбции.

Выше было описано только формирование адсорбционного монослоя. Теоретическое описание полимолекулярной адсорбции белков в настоящее время еще не создано, однако имеется ряд моделей, успешно описывающих такую адсорбцию в некоторых частных случаях.

Адсорбированные на границе раздела молекулы белка при достаточно плотном расположении взаимодействуют между собой, образуя конденсационно-кристаллизационные или коагуляционные структуры. Их механические свойства играют важную роль в стабилизации эмульсий, в том числе и газовых.

При малых концентрациях белка в растворе (10-5—10-4 г/100 мл) сформировавшиеся на поверхности адсорбционные слои проявляют свойства, характерные для ньютоновских жидкостей, — зависимость скорости деформаций в от напряжения сдвига Р прямолинейная, наклон ее определяется вязкостью адсорбционных слоев. Увеличение концентрации до 10~3—10-1 г/100 мл приводит к появлению твердообразных свойств, т. е. зависимость в от Р становится нелинейной, характеризующейся двумя пределами текучести РК1 и Рк2. При напряжениях сдвига, меньших РК1, деформации адсорбционных слоев обратимы. Обратимость деформации обеспечивается изменением энтропии, связанным с изменением взаимной ориентации молекул белков в адсорбционном слое.

Значениям предельного напряжения сдвига, большим РК1, отвечает участок на зависимости в от Р, характеризующийся медленной ползучестью с пластической вязкостью г|*о- В этой области происходят незначительные разрушения межбелковых связей, которые при малой скорости успевают восстановиться.

При напряжениях сдвига выше Рк2 коагуляционная структура белков в адсорбционном слое разрушается и слой течет с минимальной пластической вязкостью ц*.

Рассмотрим характеристики адсорбции, а также реологические характеристики адсорбционных слоев, образуемых важнейшими пищевыми белками.

Гибкие макромолекулы, такие как Р-казеин, являются очень поверхностно-активными, но формируют пленки с низкой вязкоэластичностью. Глобулярные протеины (лизоцим, Р-лактоглобулин, яичный альбумин) образуют гораздо более «жесткие» пленки1. С помощью рентгеноструктурных методов и методов нейтронного рассеяния было показано[2] , что адсорбционные пленки содержат тонкий слой (0,8—1 нм) с очень высокой плотностью расположения фрагментов протеиновых молекул и слой с низкой электронной плотностью, обращенный к водной фазе, возможно, образованный гидрофильными участками молекул, имеющими форму петель.

Из зависимостей равновесного двумерного давления от концентрации (рис. 6.1), измеренных при pH среды, равном 5, следует, что формирование адсорбционных слоев сывороточных белков и казеина происходит при значительно меньших концентрациях протеина в растворе, чем в случае соевых белков.

Зависимость поверхностного давления различных белков от логарифма концентрации в растворе

Рис. 6.1. Зависимость поверхностного давления различных белков от логарифма концентрации в растворе:

--сывороточные белки;...........— казеин;----конглицин

Кроме того, величина поверхностного давления, характеризующая полку насыщения кривой «л — С» для молочных белков, существенно выше, чем у соевых, при pH = 5.

Пониженная интенсивность формирования адсорбционных слоев у соевых белков при величинах pH, близких к изоэлектрической точке, может быть связана с агрегацией протеинов в объеме и на границе раздела фаз (т. е. возможно, что обнаруженные эффекты обусловлены тем, что соевый белок в этих условиях адсорбируется в основном не в молекулярном виде, а в виде агрегатов[3]).

Если каким-либо образом изменить площадь поверхности жидкости, то изменится и поверхностное давление. По экспериментальной зависимости поверхностного давления от площади (л—5-кривым) можно судить о физических свойствах адсорбированных слоев.

На рис. 6.2 представлены л—5-кривые для адсорбированных монослоев различных белков на поверхности при pH — 7. При pH — 5 л—5-кривая, например для конглицина, сдвинется влево — в сторону меньших площадей, при этом значению площади, например 0,3 будет соответствовать меньшее значение л.

Зависимость поверхностного давления различных белков от логарифма концентрации в растворе

Рис 6.2. Зависимость поверхностного давления различных белков от логарифма концентрации в растворе: а —pH = 5; б —pH = 7;

--сывороточные белки;...........— казеин;----конглицин; -----— глицинии;-----обработанный в дитиотреитоле глицинии

Молочные и соевые белки в монослое имеют две разные структуры — конденсационное состояние и фазу коллапса, т. е. разрушения структуры монослоев. Поверхностное натяжение пк, при котором происходит переход из одного состояния в другое, может быть вычислено по наклону л—S-характеристик (зависимостей поверхностного давления от площади монослоев). Неупорядоченные белки, такие как казеин, при низких поверхностных давлениях существуют как цепи с аминокислотными сегментами, локализованными на границе раздела. При повышении поверхностного давления аминокислотные сегменты распространяются под адсорбционный слой в водный раствор и принимают форму петель и «хвостов».

Как и для большинства глобулярных протеинов, при низких поверхностных давлениях аминокислотные остатки в молекулах сывороточных и соевых белков принимают конформацию петель на границе «раствор — воздух». Но конформация петель становится более конденсированной при повышенных поверхностных давлениях и смещается по направлению к объемной фазе (водному раствору) в точке коллапса. В соответствие с различием структуры величина пк при росте pH у соевых белков растет, а у казеина — падает.

Так как для фазы коллапса характерно резкое увеличение десорбции белка с границы раздела, величина як может играть существенную роль для оценки способности различных белков накапливаться в пене при флотационном разделении.

Топография монослоев, которую определяли с помощью микроскопии под углом Брюстера (Brewster angle microscopy — ВАМ), показывает различие между монослоями молочных и соевых белков как функцию pH, что подтверждает заключения, сделанные из л—S-изотерм.

Монослои сывороточных белков и казеина однородны по толщине и, кроме того, характеризуются изотропией. Некоторые складки на монослоях обнаруживаются лишь при поверхностных натяжениях, соответствующих их коллапсу.

Соевые белки дают совершенно другие ВАМ-изображения.

При pH = 5 как (3-конглицин, так и глицинии имеют оптически однородную поверхность монослоев, при pH = 8 (3-конглицин имеет крупные домены на границе раздела, а глицинии оптически однороден, обнаруживая некоторые складки лишь при поверхностном натяжении, соответствующем коллапсу монослоев.

Коэффициент отражения света от монослоев растет при увеличении двумерного давления, что связывают с увеличением толщины в процессе перехода от более растянутой к более конденсированной структуре, и особенно в точке коллапса. Важной особенностью поведения л—S-кривых исследованных белков является их сдвиг по оси площадей при изменении pH раствора. Сдвиг кривой в сторону больших или меньших площадей означает соответственно растяжение или сжатие (уплотнение или конденсацию) монослоя.

Анализируя сдвиги п—5-кривых, можно следующим образом охарактеризовать соевые и молочные белки.

  • 1. Конглицин. При pH = 7 имеет растянутую структуру слоев, находится в адсорбированных слоях в состоянии, близком к нативному. При pH = 5 имеет в адсорбционных слоях денатурированное состояние. В процессе денатурации происходят агрегация белковых молекул, сжатие монослоев и соответствующий сдвиг тс—5-кривых в сторону меньших площадей.
  • 2. Глицинии. При pH — 7 имеет конденсированную структуру благодаря интермолекулярным дисульфидным связям (в нативном состоянии). По-видимому, конденсированная структура глицинина более устойчива к разрушению при сжатии — коллапсу, что объясняет различие ВАМ-изображений поверхности монослоев конгли-цина и глицинина при pH = 8. Когда водородный показатель среды становится равным 5, глицинии сохраняет конденсированную структуру, но при этом происходит денатурация его молекул. Однако так как при pH = 7 он уже имел конденсированную структуру, то л—5-кривые не сдвигаются. Из-за дисульфидных связей агрегация молекул в монослоях затруднена.
  • 3. Химически модифицированный обработкой в дитиотреитоле (ДТТ) глицинии при pH = 7 уже имеет в значительной степени развернутые молекулы, так как при обработке в ДТТ происходит разрыв дисульфидных связей. Однако структура молекул этого белка такова, что он предпочитает вступать в контакты молекул не с соседними молекулами, образуя агрегаты, а с поверхностью. Поэтому возрастает число точек контактов молекулы с поверхностью, что приводит к расширению поверхностного слоя.

Как результат, при pH — 7 л—5-кривые ДТТ-глицинина сдвинуты в сторону больших площадей по сравнению с соответствующими кривыми других белков. Снижение водородного показателя до 5 приводит к денатурационным изменениям структуры молекул, их агрегации в конденсированные монослои и соответствующему сдвигу л—5-характеристик в сторону меньших площадей.

  • 4. При нейтральных значениях pH казеин имеет структуру неупорядоченного клубка, находится в нативном состоянии, адсорбционные слои растянуты. Изменение pH до 5 ведет к агрегации казеина, сжатию адсорбционных слоев и, соответственно, сдвигу л—5-кривых в сторону меньших площадей.
  • 5. Сывороточные белки при pH = 7 в адсорбционных слоях в значительной степени сохраняют элементы нативной структуры молекул, адсорбционные слои растянуты. Однако такая растянутая структура слоев оказывается достаточно устойчивой к разрушению при сжатии, как это следует из ВАМ-изображений монослоев.

Если же pH раствора принимает значение 5, то сывороточные белки в отличие от остальных перечисленных протеинов остаются в растянутом состоянии, сохраняя при этом нативную структуру. Поэтому п—S-характеристики при изменении pH от 7 до 5 практически не сдвигаются.

Скорость изменения структурных характеристик монослоев со временем старения выше для соевых белков, чем для молочных.

Кинетические зависимости поверхностного натяжения растворов соевых белков в диапазоне концентраций 0,01—0,1 % обнаруживают наличие периода «скрытой адсорбции» (lag-time), когда в начальные участки времени поверхностное натяжение близко к нулю и лишь затем медленно нарастает. Существование периода lag-time связано с агрегацией соевых белков при pH, близком к изоэлектрической точке. При pH = 7 период lag-time исчезает. Казеин и сывороточные белки не обнаруживают периода lag-time при любых значениях pH в указанном диапазоне концентраций. Это согласуется с тем фактом, что гибкость структуры и чувствительность к конформационным изменениям (изменения свойств четвертичной структуры при изменении конформации) выше у молочных белков чем у соевых, что облегчает формирование адсорбционных слоев молочных белков при различных условиях.

В адсорбции исследованных белков можно выделить три основных стадии:

  • 1) диффузии протеинов к границе раздела или конвективного переноса агрегатов;
  • 2) адсорбция и разворачивание протеинов на границе раздела фаз;
  • 3) перестройка протеиновых сегментов на жидкой границе и дальнейший медленный процесс реорганизации аминокислотных остатков, предварительно закрепленных на границе раздела.

Для всех исследованных белков (соевые и сывороточные белки, казеин) при низких поверхностных давлениях (л < 10 мН/м) экспериментальные результаты находятся в хорошем соответствии с уравнением (6.7), т. е. наблюдается линейная зависимость л от т1/2. Период времени, за который адсорбция протекает под диффузионным контролем, растет с уменьшением концентрации белков в растворе. Диффузия молочных белков протекает быстрее, чем соевых, что может быть связано с различием молекулярной массы белков, а также с агрегацией соевых белков в растворе. Этим же объясняется то, что период, при котором адсорбция идет под диффузионным контролем, резко увеличивается для соевых белков при pH = 5.

Вторая и третья стадии адсорбции определяются каждая своим энергетическим барьером, на которых обнаруживаются два линейных участка на кинетической кривой в координатах lg[fa180-- л0)/л180 - лт] от т, где л180, л0, лт — соответственно поверхностные 140

давления через 180 с, 0 с и спустя время т после начала адсорбции. Наклон первого участка КА определяется величиной энергетического барьера, связанного с разворачиванием белковых молекул на границе раздела, наклон второго К2 соответствует барьеру, обусловленному реорганизацией протеиновых сегментов на границе раздела. Величина К] увеличивается с ростом концентрации протеинов, т. е. проникновение белков к границе раздела и закрепление на ней облегчаются при увеличении концентрации белка в растворе.

Реологические характеристики одного из глобулярных пищевых белков — яичного альбумина — при адсорбции на границе раздела «воздух — водный раствор» в зависимости от pH раствора исследованы совместно с характеристиками, полученными методом эллипсометрии[4].

Эллипсометрия является одним из распространенных неразрушающих методов экспериментального определения толщины и показателя преломления тонких пленок на поверхности твердых тел или жидкостей. При исследованиях этим методом определяются эллипсометрические параметры у и А, характеризующие поляризованный свет, отраженный от исследуемой поверхности, покрытой тонкой пленкой. Эллипсометрический параметр у и связан с углом поворота плоскости поляризации света после отражения от поверхности, а А — со сдвигом фаз между волнами, поляризованными во взаимно-перпендикулярных плоскостях. В виде совокупности этих волн можно представить излучение, отраженное от исследуемой поверхности.

Эллипсометрические параметры щ и А дают возможность определить толщину адсорбционного слоя, по которой можно посчитать величину адсорбции (поверхностной концентрации) Г. Так как при малых толщинах пленок при изменении толщины изменяется параметр А, а величина |/ остается практически постоянной, можно найти связь между Г и А. Еще одна возможность прямого определения величины адсорбции состоит в использовании радиоактивных меток.

Кроме того, проводились измерения поверхностного давления и поверхностного модуля эластической деформации ц. Эллипсометрические измерения и определение поверхностного давления, а также реологические испытания совместно с эллипсометрией проводились одновременно, на одних и тех же образцах.

Выяснилось, что максимум кривой ц(рН) приходится на величину pH — 4,6, близкую к изоэлектрической точке яичного альбумина.

Величина поверхностного давления л раствора белка значительно выше при pH = 4,6, чем при pH = 6.

В то же время адсорбция Г сохраняется примерно на одном и том же уровне при любых значениях pH в диапазоне 4—8.

Полученные результаты могут быть объяснены следующим образом. В процессе конформационных изменений белка, протекающих при адсорбции, сначала происходит частичное разворачивание адсорбционных молекул, которое имеет результатом увеличение площади выходящих на поверхность молекул гидрофобных участков. Этот процесс может быть затруднен при высоком поверхностном давлении, и, таким образом, степень разворачивания молекул ниже в пленках, адсорбированных при высоких концентрациях белка в растворе (так как поверхностное давление растет при увеличении объемной концентрации).

Таким образом, в пленках с одинаковой поверхностной концентрацией степень денатурации адсорбированного белка может быть совершенно различной в зависимости от содержания белка в объеме жидкой фазы. Одновременно с продолжающимся разворачиванием молекул происходит формирование двумерной структуры (2П-сетки) благодаря эффекту взаимодействия (в основном гидрофобного) белковых молекул в адсорбционном слое. Эта 2П-сетка определяет вязкоупругие свойства адсорбированных слоев.

Заряд протеинов влияет в основном на образование 2П-сетки, так как электростатическое отталкивание препятствует гидрофобным межмолекулярным контактам. В диапазоне pH = 4-^6, в котором проводились исследования влияния электрических взаимодействий на структуру белковых систем, по-видимому, электростатическое отталкивание незначительно ограничивает максимальную величину адсорбции, но, препятствуя образованию межмолекулярных связей, в значительной степени предотвращает нарастание поверхностного давления и поверхностного модуля эластической деформации, и они остаются достаточно низкими.

При pH, близком к изоэлектрической точке овальбумина, малая величина заряда позволяет молекулам в адсорбционном слое достаточно сблизится для образования эффективных межмолекулярных связей.

Величина pH водного раствора белка влияет и на зависимость поверхностных реологических характеристик от концентрации раствора. При pH = 4,6 наблюдается сильный рост модуля эластичности в диапазоне концентраций 0,1—1,0 г/л. Увеличение pH до 6,0 приводит к тому, что р гораздо слабее меняется в том же диапазоне концентраций. При обоих значениях pH поверхностная концентрация Г не меняется с увеличением концентрации в объеме выше 0,1 г/л.

Эти явления объясняются увеличением плотности протеин-про-теиновых взаимодействий в адсорбционной пленке. В условиях 142

слабого электростатического отталкивания, при величине pH, близкой к изоэлектрической точке, степень разворачивания молекул, которая контролируется концентрацией белка в растворе, является очень существенной для развития вязкоупругих свойств, так как «раскрученные» молекулы легче образуют гидрофобные межмолекулярные контакты, чем свернутые в глобулы.

Однако возникает вопрос — если энергетический барьер адсорбции определяется степенью разворачивания молекул, то величина поверхностной концентрации так же должна определяться степенью поверхностной денатурации молекул.

Реологические характеристики также зависят от степени разворачивания молекул. Но в этом случае величина адсорбции и реологические характеристики должны меняться синхронно с изменением pH, однако на практике наблюдается обратное явление. Эта проблема требует дальнейших исследований.

Перспективным в этом отношении является метод поляризаци-онно-модулированной инфракрасной отражательно-поглощательной спектроскопии (РМ-1ККА5), позволяющий характеризовать конформацию органических молекул, адсорбированных на жидкой границе раздела, и в частности вторичную структуру адсорбированных пептидов и протеинов[5]. В частности, этим методом обнаружено, что процесс старения пограничных слоев включает медленную модификацию вторичной структуры адсорбированного яичного альбумина. Так называемые р-листы (см. подтему 4.1), формирующиеся при изменениях вторичной структуры в процессе старения адсорбированных слоев, включаются в 2П-сетку, которая ответственна за когезию границы раздела.

Молекула яичного альбумина имеет четыре сульфогидрильные группы и одну дисульфидную связь. В процесс формирования 2П-сетки могут быть вовлечены и явления сульфгидрил-дисульфидного обмена, что должно повлиять на реологические свойства слоев. Однако в том диапазоне pH, где сульфгидрил-дисульфидный обмен становится существенным, резко возрастает электростатическое отталкивание молекул. Низкая эластичность слоев при таких значениях pH даже при высоких объемных концентрациях показывает, что вклад ковалентных протеин-протеиновых взаимодействий остается весьма ограниченным.

Поверхностные реологические свойства адсорбционных слоев определяют многие явления, происходящие при переработке пищевого сырья, и в частности поведение пен, их стабильность. Так, при pH = 4,8, когда эластичность протеинов яичного белка максимальна, пенообразующая способность и стабильность пен также максимальны, а пузырьки имеют минимальные размеры1.

Стабильность пен и пенообразующая способность зависят главным образом не от сдвиговых, а от дилатантных реологических свойств адсорбционных слоев.

Дилатантный модуль упругости определяется изменением поверхностного давления при малом изменении площади поверхности адсорбционного слоя (при этом форма поверхности остается постоянной):

Этот модуль может быть понят как полное сопротивление поверхностного покрытия дилатантным деформациям, т. е. растяжению и сжатию. Дилатантный модуль является комплексным числом, содержащим как эластический Е', так и вязкий Е" компоненты, соответствующие энергии, возвращающейся и теряемой во время поверхностной деформации (т. е. комплексная часть дилатантного модуля связана с рассеянием энергии). Эластическая и вязкая компоненты дилатантного модуля упругости могут быть измерены по амплитуде и сдвигу фаз поверхностного давления при синусоидальном изменении площади поверхности.

В отличие от дилатантного, поверхностный сдвиговый модуль упругости определяется силами, появляющимися при сдвиге поверхностного покрытия в плоскости, параллельной границе раздела, при этом площадь поверхности остается постоянной, меняется только ее форма. Основное различие между дилатантной и сдвиговой реологией заключается в том, что поверхностная концентрация при измерениях сдвигового модуля упругости остается постоянной.

Дилатантные реологические свойства связаны не с равновесной величиной поверхностного давления, а со способностью протеинов быстро изменять поверхностное давление. Это качество коррелирует с увеличением пенообразующей способности белков.

Так, гидролизаты сывороточных белков по сравнению с изоля-том сывороточного белка и водными растворами а-лактоальбумина и р-лактоглобулина образовывали пены с большей устойчивостью к разрушению[6] . Выше была также пенообразующая способность гидролизатов.

Действительно, увеличение скорости адсорбции протеиновых фрагментов, образующихся в результате гидролиза, происходящее благодаря большему коэффициенту диффузии гидролизатов по сравнению с неразрушенными белками, в основном отвечает за улучшение способности гидролизатов образовывать и сохранять пену.

Факторы, которые уменьшают заряд белковых молекул (близкая к изоэлектрической точке величина pH или высокая ионная сила раствора) оказывают влияние на скорость адсорбции протеинов на границе раздела и увеличивают дилатантный модуль упругости, а также повышают устойчивость пены к разрушению. Эластическая компонента дилатантного модуля упругости коррелирует с устойчивостью пены к разрушению.

Глобулярные протеины, такие как (З-лактоглобулин, овальбумин или лизоцим, склонны к формированию более вязкоупругих пленок по сравнению с менее упорядоченными протеинами, такими как |3-казеин. Это объясняется тем, что гибкий казеин не передает силу через границу так эффективно, как жесткий глобулярный протеин.

Добавление поваренной соли к растворам изолята сывороточных белков при значениях pH выше или ниже изоэлектрической точки увеличивает адсорбцию протеинов, так как противоионы соли частично экранируют заряд белковых молекул. Однако увеличение ионной силы раствора не может полностью нивелировать влияние фактора pH на адсорбцию. При добавлении ЫаС1 несколько увеличивается дилатантная эластичность слоев, хотя это увеличение минимально для изолята молочной сыворотки при pH = 7. Ослабленная дилатантная эластичность слоев сывороточных белков, адсорбированных при pH = 3, объясняет уменьшение устойчивости к разрушению пен, сформированных белками молочной сыворотки в кислых растворах.

На адсорбцию белков на границе раздела фаз оказывает влияние также присутствие в растворе полисахаридов[7]. В диапазоне pH — 4^-8 заряд полисахаридов, как правило, отрицательный, поэтому ниже изоэлектрической точки белки с полисахаридами образуют комплексы из-за электростатического взаимодействия противоположно заряженных молекул. Выше изоэлектрической точки из-за электростатического отталкивания имеет место термодинамическая несовместимость между белками и полисахаридами. Следовательно, белки и полисахариды могут сосуществовать в чистых фазах в областях, где они взаимно исключают друг друга, либо выше некоторой критической концентрации может происходить сегрегация в две различные фазы.

Гидрофильные полисахариды и полисахариды с гидрофобными группами по-разному влияют на адсорбцию протеинов.

Примером гидрофильных полисахаридов может служить ксан-тан. Растворенный в воде чистый ксантан не адсорбируется на границе раздела. Однако в смеси с белками благодаря кооперативным эффектам он способствует значительному повышению поверхностного давления адсорбированных слоев по сравнению с растворами чистых белков. Аналогично ведут себя и гидрофильный полисахарид Х-каррагенан, а также низкометоксилированные пектины.

Поверхностно-активные полисахариды в смеси с белками также повышают поверхностное давление, однако они менее эффективны, чем гидрофильные полисахариды. Это объясняется конкуренцией при адсорбции белков и полисахаридов на границе раздела.

На адсорбцию протеинов из водных растворов оказывают влияние также добавки поверхностно-активных веществ, как ионогенных, так и неионогенных[8]. Для изучения влияния таких добавок на адсорбцию формируют поверхностную структуру путем укладки слоев Лэнгмюра — Блоджет на слюду и затем исследуют атомносиловой микроскопией. В результате подобных исследований была предложена так называемая орогеническая модель, которая раскрывает, каким образом протеины размещаются на границе раздела совместно с поверхностно-активными веществами.

Гетерогенность в адсорбционных слоях позволяет молекулам ПАВ внедриться в дефекты структуры слоев, образуя ядра. Плотность расположения таких ядер связана с типом ПАВ. Так, заряженные молекулы ПАВ образуют больше ядер на единицу площади. Вокруг ядер затем формируются области, содержащие ПАВ-домены. Расширение доменов сжимает структуру протеинового адсорбционного слоя, который вначале увеличивает плотность, без роста толщины. Другими словами, пока не достигается некоторая критическая плотность протеинового слоя, его толщина увеличивается таким образом, что полный объем протеиновой пленки остается постоянным, так как внедренные в структуру протеинового слоя домены постоянно расширяются.

При достаточно высоких поверхностных давлениях непрерывная структура протеинового слоя разрывается, при этом часть протеинов переходит в водный раствор. Это приводит к состоянию, когда поверхность можно сравнить с морем ПАВ, содержащих островки протеинов, которые затем десорбируются с границы раздела. Обнаружено, что размер доменов, формируемый ионогенными ПАВ, определяется уровнем сил межмолекулярного отталкивания. Электростатическое экранирование поверхностных зарядов приводит к увеличению размера доменов. Поверхностное давление, при котором структура протеинов разрывается, зависит от типа ПАВ, однако во всех случаях для ионогенных ПАВ оно выше, чем для неионогенных.

Все вышеописанные особенности адсорбции белков оказывают влияние на процесс электрофлотации.

  • [1] Phan С. М., Nguyen А. V., Evans G. М. Dynamic adsorbtion of beta-casein at the gasliquid interface // Food Hydrocolloids. 2009. № 20. P. 299—304.
  • [2] Graham D. E., Phillips M. C. Protein at liquid interfaces V. Shear properties // Journal of Colloid and Interface Science. 1980. № 76. P. 240—250. 2 Hazzallah B. A. et al. Structural study of beta casein adsorbed layers at the airwater interface using x-ray and neutron reflectivity // International Journal of Biological Macromolecules. 1998. № 23. P. 73—84. 3 Nino M. R. R. et al. Milk and soy protein films at the air-water interface // Food Hydrocolloids. 2005. № 19. P. 417—428. 4 Carrera C. et al. Soy globulin spread films at the air-water interface // Food Hydrocolloids. 2003. № 18. P. 335—347.
  • [3] Carrera C. et al. Effect of pH on structural, topographical, and dynamic characteristics of soy globulin films at the air-water interface // Langmuir. 2005. № 19. P. 7478—7487.
  • [4] Pezenn.ec S. et al. The protein netelectric charge determines the surface rheological properties of ovalbumin adsorbed at the air-water interface // Food Hydrocolloids. 2000. № 14. P. 463—472.
  • [5] Blaudez D. et al. Investigations at the air-water interface using polarization modulation IR spectroscopy // Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 1996. № 92. P. 525—530.
  • [6] Hammershoj M., Prins A., QyistK. B. Influence of pH on surface properties of aqueous egg albumen solutions in relation to foaming behaviour // Journal of the Science of Food and Agriculture. 1999. № 79. P. 859—868. 2 Foegeding E. A., Luck P. J., Davis J. P. Factors determining the physical properties of protein foams // Food Hydrocolloids. 2006. № 20. P. 284—292.
  • [7] Baeza R. et al. Interaction of polysacchrides with |3-lactoglobulin adsorbed films at the air-water interface // Food Hydrocolloids. 2005. № 19. P. 239—248.
  • [8] Gunning Р. A. et al. The effect of surfactant type on protein displacement from the air-water interface // Food Hydrocolloids. 2004. № 18. P. 509—515.
 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >