Меню
Главная
Авторизация/Регистрация
 
Главная arrow Агропромышленность arrow Общая фитопатология

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-litne PCR)

ПЦР в реальном времени — более быстрый и удобный метод диагностики фитопатогенов по сравнению с классической ПЦР. Он дает информацию не только о присутствии, но и о количестве патогена в исследуемом образце непосредственно после этапа амплификации и не требует отнимающей дополнительное время стадии электрофоретического разделения продуктов. Отсутствие электрофоретического разделения снижает риск загрязнения тестируемых проб ампликонами.

Метод Real-Time PCR основан на свойствах особых, способных к флуоресценции молекул — флуорофоров поглощать свет одной длины волны и испускать свет другой, большей длины волны. Физика этого явления следующая. Поглощение света флуорофором переводит электроны части атомов на более высокие энергетические уровни (возбуждение). Электроны остаются в возбужденном состоянии около 10-8 с, после чего атом переходит в нормальное состояние, испуская при этом фотон. Поскольку часть энергии возбужденного электрона рассеивается при этом в тепло, длина волны испускаемого света всегда ниже длины волны поглощаемого (сдвиг Стокса). Процесс флуоресценции состоит из многократно повторяющихся циклов поглощения-испускания фотонов.

Все существующие в настоящее время системы регистрации накопления продуктов ПЦР основаны на измерении флуоресценции реакционной смеси. Специальными методами достигают того, чтобы интенсивность флуоресценции была пропорциональна количеству наработанной в ходе реакции ДНК.

Флуорофоры и гасители люминесценции

Большинство флуоресцирующих соединений, используемых в Real-Time PCR, представляют собой гетероциклические или полиароматические углеводороды. По принципу использования в Real-Time PCR их можно разделить на две группы:

дуплекс-специфичные интеркалирующие (т.е. способные встраиваться в молекулу ДНК между парами оснований) красители;

— красители для мечения олигонуклеотидов.

Дуплекс-специфичные интеркалирующие (далее — интеркалирующие) красители характеризуются способностью изменять квантовый выход (отношение числа выпущенных фотонов к числу фотонов, поглощенных флуорофором) при связывании с двуцепочечной молекулой ДНК или РНК. Сюда относятся такие соединения, как бромистый этидий, "SYBR Green I", "SYBR Gold" и др.

Квантовый выход красителей для мечения олигонуклеотидов не зависит от образования комплекса с ДНК. Их присоединяют к синтетическим олигонуклеотидам в процессе синтеза праймеров или проб (главным отличием пробы от праймера является блокировка 3' конца пробы от удлинения ДНК-полимеразами).

Для оценки выхода целевых ПЦР-продуктов во время реакции используют комплекс флуорофора с гасителем флуоресценции (конструирование проб будет рассмотрено далее). Гасителями называют вещества, уменьшающие квантовый выход процесса флуоресценции. Все гасители можно разделить па две группы:

  • — флуоресцирующие;
  • — темновые.

Флуоресцирующие гасители, одновременно со способностью снижать квантовый выход флуорофора, сами являются хорошими флуорофорами. Полученную от флуорофора энергию они переизлучают в свет другой длины волны. Темновые гасители рассеивают полученную энергию в виде тепла.

В Real-Time PCR гасители используют в комплексе с красителями для мечения нуклеотидов таким образом, чтобы снятие гашения (и соответствующее ему увеличение флуоресценции) соответствовало образованию ДНК в ходе ПЦР.

 
Если Вы заметили ошибку в тексте выделите слово и нажмите Shift + Enter
< Предыдущая   СОДЕРЖАНИЕ   Следующая >
 

Популярные страницы