Хроматография

Различные сорбционные процессы лежат в основе такого важного метода физико-химических исследований, как хроматография.

Хроматография представляет собой динамический метод анализа, основанный на многократно повторяющихся процессах сорбции и десорбции.

Хроматография как явление и метод исследования была открыта русским ученым М. С. Цветом в 1903 г. при экспериментах по изучению компонентов хлорофилла.

Обязательным условием для проведения хроматографии является наличие двух фаз: неподвижной (стационарной) и подвижной. В результате того что различные вещества (А, Д, Н) перемещаются вдоль стационарной фазы с разной скоростью, происходит их разделение (рис. 23.19). Хроматография — один из немногих методов, сочетающий в себе и разделение, и количественное определение веществ, входящих в состав многокомпонентных проб.

Хроматографическое разделение веществ

Рис. 23.19. Хроматографическое разделение веществ

Различная скорость перемещения отдельных компонентов смеси вдоль стационарной фазы связана со сложным характером взаимодействия в системе "вещество — подвижная фаза — неподвижная фаза". По доминирующему механизму различают адсорбционную, распределительную, ионообменную, хемосорбционную и молекулярно-ситовую хроматографию.

Адсорбционная хроматография основана на различии в адсорбционных свойствах разделяемых веществ. Компоненты, не адсорбирующиеся стационарной фазой, будут во время анализа находиться только в подвижной фазе, скорость их перемещения вдоль стационарной фазы будет максимально возможной. Наоборот, хорошо адсорбирующиеся компоненты будут медленно передвигаться вдоль стационарной фазы.

Распределительная хроматография основана на различиях в коэффициентах распределений, представляющих собой отношение концентрации вещества в неподвижной фазе — жидкости к концентрации вещества в подвижной фазе — газе или жидкости.

В ионообменной хроматографии разделение вещества связано с различием термодинамических констант ионного обмена определяемых ионов.

Хемосорбционная хроматография включает в себя несколько вариантов хроматографических процессов, общим для них является различие в термодинамических константах того или иного вида химического равновесия: констант растворимости (осадочная хроматография), констант нестойкости комплексных соединений (адсорбционно-комплекснообразовательная хроматография), констант реакций с переносом электрона (редокс-хрома- тография).

К хемосорбционной хроматографии относится и биоспецифическая (афинная) хроматография, основанная на специфичности взаимодействия, лежащего в основе биологической функции фермента. Стационарная фаза содержит либо фермент, либо субстрат, в результате чего из анализируемой смеси с высокой степенью специфичности будет "вылавливаться" партнер соответствующей фермент-субстратной реакции.

Молекулярно-ситовая хроматография (устаревшее название — гель- фильтрация) позволяет анализировать смеси, содержащие вещества со значительно различающимся размером молекул. В качестве стационарной фазы используют пористые тела — молекулярные сита, которые являются проницаемыми для молекул только определенного размера. Крупные молекулы, не попадая в поры, перемещаются вдоль стационарной фазы быстрее, чем мелкие. Молекулярно-ситовая хроматография чрезвычайно широко применяется в биохимии для разделения смесей биополимеров (например, белков) на фракции.

Приведенная классификация хроматографических методов не является единственной. В некоторых случаях хроматографические методы принято классифицировать по агрегатному состоянию применяющихся фаз (табл. 23.1).

С точки зрения техники эксперимента принято различать колоночную (см. рис. 23.19) (разновидность — капиллярная), бумажную и тонкослойную хроматографию (ТСХ).

Таблица 23.1

Классификация хроматографических методов по агрегатному

состоянию фаз

Неподвижная фаза

Подвижная фаза

жидкость (жидкостная хроматография) ЖХ

газ (газовая хроматография) ГХ

Твердое тело (адсорбционная хроматография)

Жидкостно-твердо-фазная (жидкостно-адсорбционная хроматография) Ж АХ

Газо-твердофазная (газоадсорбционная хроматография) ГАХ

Жидкость, нанесенная в виде пленки на инертный носитель

Жидкостно-жидкостная хроматография ЖЖХ

Газо-жидкостная хроматография гжх

Хроматографическая методика состоит из следующих основных этапов: 1) подготовка анализируемой пробы и сорбента (колонки или тонкого слоя); 2) нанесение пробы на тонкий слой сорбента, бумагу или ввод ее в разделительную колонку; 3) собственно хроматографирование; 4) обнаружение зон разделенных веществ — детектирование, иногда этот этап неправильно называют проявлением; 5) количественное определение содержания вещества в разделенных зонах.

На рис. 23.20 представлена типичная хроматограмма, полученная при разделении трех лекарственных веществ с применением методики ТСХ.

Тонкослойная хроматография

Рис. 23.20. Тонкослойная хроматография:

С — место нанесения смеси на пластинку; II — зона новокаина;

А — зона анестезина; Д — зона дикаина (растворитель — смесь ацетон — хлороформ 1:1, сорбент — силикагель)

Для идентификации веществ на хроматограмме используется степень разделения — величина Яр представляющая собой отношение пути, пройденного веществом, /(X), к пути, пройденному растворителем, /(Р). Например, для новокаина (X = Н): Яу = /(Н)//(Р).

Для проведения более точных анализов применяют хроматографы (газовые или жидкостные) — физико-химические приборы, поддерживающие все параметры хроматографического разделения на заданном уровне и преобразующие сигнал детектора в форму, удобную для количественного определения содержания веществ.

Пример 23.3. На рис. 23.21 представлена хроматограмма той же смеси трех лекарственных веществ, что и на рис. 23.20, но полученная с использованием методики ГЖХ.

Газо-жидкостная хроматограмма смеси

Рис. 23.21. Газо-жидкостная хроматограмма смеси:

новокаин (II), анестезин (А), дикаин (Д); сорбент — 3% полиэтилеигликоальдигшната на дипохроме Н. Т = 573 К

Идентификация лекарств проводится по времени удерживания: в указанных условиях хроматографирования анестезин (А) = 102 с, новокаин (Н) = 495 с, дикаин (Д) = 765 с. Площадь пика каждого вещества пропорциональна его содержанию (при малых концентрациях, когда изотерма сорбции прямолинейна).

Хроматографию широко применяют в медико-биологических исследованиях и в клинической практике.

Анализ крови на присутствие в ней алкоголя, наркотиков, летучих веществ, вызывающих токсикоманию, проводится с помощью хроматографии за считанные минуты. Хроматография является незаменимым методом для допинг-контроля (обнаружение стимулирующих веществ в организме спортсменов). С помощью хроматографии в биологических жидкостях можно выявить микрокомпоненты (не определяемые другими методами), которые появляются при наличии той или иной патологии. Значение хроматографии как важного диагностического метода постоянно возрастает.

 
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ     След >